Katzenzunge im DIC

[Holger Adelmann]

Guten Abend.

Mein heutiger Beitrag zeigt, dass man auch gefärbte Präparate durchaus mal im DIC anschauen sollte (wenn nicht zu intensiv gefärbt).
In dem geposteten Beispiel eines Schnittes durch eine Katzenzunge profitiert hierbei insbesonders das kollagene Bindegewebe. Leitz NPL Fluotar 40:1 DIC

Ich habe auch noch zwei Bilder (Moticam 2300) in voller 3 MegaPixel Auflösung eingestellt, das erste ist ein "Rohbild" direkt von der Moticam, das zweite mit Kontrastmaximierung in Image-Pro:

Raw: http://www.fotos-hochladen.net/zungekatzerawmotixzyt0o5e.jpg

Kontrastangepasst: http://www.fotos-hochladen.net/zungekatzecontrastlzh1ijd3.jpg

Ich verwende bei der Bildaufnahme mit der Moticam üblicherweise die Echtzeit-Gammafunktion, dies verhindert oft "Clipping" bei der Billdaufnahme, d.h. Pixel-Sättigung in sehr hellen oder dunklen Bildpartien, auch wenn die Bilder zunächst dadurch etwas weicher, kontrastärmer wirken. Diese Methode ermöglicht aber eine Aufnahme, welche optimale Voraussetzungen zur Nachbearbeitung bietet.

Viel Spass
Holger

[Ronald Schulte]

Holger,

DIC ist zwar für mich ein total unbekannte Umgebung aber das seht gut aus.
Ist das RAW Bild Gans ohne Nachbearbeitung?

Könntest du mal ein Bild zeigen wie dein Moticam Adaptiert ist an dein ??

Grüße Ronald

[Alfons Renz]

Lieber Herr Adelmann,

Ihre faszinierenden Bilder werfen eine interssante Frage auf: Wie gelingt es, die in einem Blutgefäß zirkulierenden Erythrozyten in einem histologischen Schnitt so zu konservieren, dass sie wie einzeln frei im Raum zu schweben scheinen? Sie liegen ja unorientiert und in großer Zahl in der Dicke des Schnitts und werden beim Färben und Waschen leicht gegespült.

Das Bild gibt uns dazu eine kleine Antwort: Fast alle sichtbaren Erythrozyten liegen flach, so wie wir sie aus einem ganz gewöhnlichen Blutausstrich kennen. Das ist aber keineswegs ihre normale Ausrichtung bei der Zirkulation in den Gefäßen. Folglich wurden vermutlich alle 'hochkant' oder 'frei im Raum' liegenden Erythrozyten weggespült, so daß nur die haften blieben, die fest auf dem Objektträger fixiert waren. Deshalb sind es auch nur so wenige!

Aber weshalb sind nur einige rot gefärbt und viele nicht? Es scheint eine entweder/oder Entscheidung zu sein, ob das Haemoglobin im Erythrozyten blieb oder nicht. Hätten Sie ein Erklärung für diese Phänomen? Und könnten Sie etwas zur Präparation und Färbung verraten?

Herzliche Grüße,

Alfons

[Ronald Schulte]

Alfons,

Auch bei mir bleiben regelmäßig die Erythrozyten im Gefäß und wird nicht immer alles ausgespült.
Sie liegen dann nie so schön flach wie im schnitt von Holger.
Gezeigt ist ein Sagittalen schnitt durch eine Vene (denke ich)

Grüße Ronald

[Holger Adelmann]

Hallo Kollegen,

gerne gebe ich noch ein paar Details.

@Ronald
ja das raw Bild ist - bis auf die beschriebene Echtzeit-Gammakorrektur schon in der Kamera - unbearbeitet.
Für diese Aufnahme habe ich die Moticam 2300 direkt am Trinotubus - ohne Okular - adaptiert. Ich verwende hierbei einen 0.63x Adapter von Leitz (siehe Bild).
Die NPL Fluotar, PL Fluotar und PL APO Leitz Objektive neuerer Bauart sind schon so hervorragend korrigiert, dass eine weitere Korrektur im Okular nicht nötig ist, ich habe hierzu einige Versuche angestellt, auch zum Farbvergrösserungsfehler unter Verwendung mehrerer Wellenlängen.




@Alfons
Der Paraffinschnitt wurde mit Serum-Glyzerin aufgeklebt, das erklärt vermutlich die Erhaltung der flach aufliegenden Erythrocyten.
Die Färbung ist eine Goldner Variante der Masson'schen Trichrom-Färbung, für mich neben Azan eine der schönsten für die Tierhistologie.
In Kürze: Kernfärbung mit Weigert's Hämatoxylin, gefolgt von Ponceau-Säurefuchsin-Azophloxin, danach Lichtgrün.
Ich habe die Anleitung im Romeis genommen, eine schöne Kurzanleitung ist hier:
http://www.aeisner.de/methoden/farb36.html


Herzliche Grüsse
Holger

[Ronald Schulte]

Holger,

So ist es besser. Die letzten zwei Bilder konnte ich nicht sehen.

Den Adapter hat also keine Linse mehr begreife ich?

Warum hast du nicht die mitgelieferte Adaption gebraucht, oder war es nicht dabei?

z.B. http://www.microscope.com/moticam-2300-megapixel-versatile-digital-microscope-camera-p-446.html

Grüße Ronald

[Holger Adelmann]

Ronald, der 0.63x Adapter hat natürlich eine (verkleinernde) Linse, um etwas mehr von dem mikroskopischen Bildfeld zu erfassen. Ich habe den von Leitz gewählt, ich denke, die Optik ist noch ein wenig besser als die von Motic 
Ich habe auch noch einen 1x Adapter, der hat keine Linse.
Holger

[Jürgen Boschert]

Hallo Holger,

nur als Anmerkung zu DIC bei gefärbten Präparaten. Mit dem DIC-System kann man blass gefärbte Präparate kontrastreicher darstellen, den DIC zum sog. Amplitudenkontrast verwenden. Dazu verdreht man Polarisator und Analysator soweit aus der Kreuzstellung, dass der 3-D-Effekt gerade verschwindet.

Beste Grüße !

JB

[Holger Adelmann]

Hallo Juergen,

das ist korrekt. Ich habe den Amplitudenkontrast auch schon am Orthoplan nachvollzogen - nach einer Originalarbeit von Georges Nomarski und Robert D Allen. Wenn ich wieder zuhause bin werden ich dazu noch Bilder und Literatur einstellen.

Der Amplitudenkontrast ist insbesonders sinnvoll, wenn das Praeparat schwach gefaerbt ist UND die Phasenstrukturen im Gewebe durch ein Einschlussmittel mit einem gewebenahen Brechungsindex unterdrueckt werden, wie dies z.B. bei Caedax (nD 1.56) der Fall ist.
Schoener Artilkel hierzu von Klaus Henkel: http://www.mikroskopie-muenchen.de/balsame.html

Der Einschluss meines gezeigten Schnittes erfolgte jedoch in Malinol (nD 1.52), welches das Strukturbild im Hellfeld gut unterdrueckt, im DIC ist es jedoch noch sichtbar, besonders bei den kollagenen Fasern im Zungenpraeparat.

Danke fuer die gute Ergaenzung, Juergen.

Herzliche Gruesse
Holger

[Holger Adelmann]

Nachtrag: Der von mir eben angesprochene Artikel von Nomarski, Allen (und David) ist auch frei im Internet zu haben:
http://www.microscopyu.com/references/pdfs/Allen_etal_Zeit_Wissen_Mikro_Tech_69-193-1969.pdf

Das PDF ist ein nicht elektronisch durchsuchbarer Scan, der Amplitudenkontrast mittels DIC Einrichtung wird ab Seite 216 des Artikels beschrieben.

Holger

[reblaus]

Hallo JB + Holger -

heißen Dank für diesen wertvollen Tip und den tollen Link!
Wer kommt schon von selbst auf den Gedanken, die Stellung des mühsam eingestellten Polarisators wieder zu verschlechtern.
Viele Grüße
Rolf