Intensitaet der Auflichtfluoreszens bei UV Erregung - eine kleine Rechnung

[chishoro]

Hallo Zusammen,

Ohne es direkt gemessen zu haben versuche ich zu rechnen was man bei verschiedenen (hier Zeiss)  Objektiven der 160er Serien an relativer Lichtausbeute erwarten kann.

Hierbei gehe von folgendem aus - die Lichtausbeute ist relativ zur 4ten Potenz der numerischen Apertur.

Die Fluoreszenz soll mit einer HBO Lampe mittels der HG Linie um 360 nm erregt werde. Verwendet wird ein Filterwuerfel mit

Erregerfilter: 366
Farbteiler: 420
Langpassfilter: 418

Der Lichtweg bis zum Filter passiert mehrfach normales Glas (also kein Quarzkollektor etc...)

Wenn ich jetzt folgende Objektive vergleiche

Objektiv               N.A.       N.A^4                 relative Lichtdurchlaessigkeit bei 365 nm     N.A.^4 * faktor
Zeiss Planapo 10   0.32   0.01048576   0.4                                                 0.004194304
Zeiss Plan 10   0.22   0.00234256   0.224                                                 0.000524733
Zeiss Neofluar 10   0.3   0.0081                0.32                                                 0.002592
Zeiss Ultrafluar 10   0.2   0.0016                0.8                                                 0 .00128

Damit wäre also das Planapo Objektiv immer noch die beste Wahl - stimmt die Rechnung (grob - Faktoren wie die unterschiedliche Deckglassdicke
resp. chromatische Korrektur habe ich jetzt beiseite gelassen...)

Quellen sind hier: Understanding the light microscope von D.J. Goldstein und Piller, H. 1977. "Microscope Photometry".

         Gruß,

                 Rory

[Werner Jülich]

Bei einer Anregungswellenlänge von 360nm dürfen Sie die Transmission nicht vernachlässigen. Wundern Sie sich daherr nicht, wenn im wirklichen Mikroskopleben die Reihenfolge anders ist.
Bei gleichem Abbildungsmaßstab können Sie sich die Rechnungen sparen, spannend sind doch eher Überlegungen wie  40x/1,25 vs.  63x/1,25 oder ähnlich.

Werner Jülich

[peter-h]

Hallo Rory,

ich käme nie auf die Idee ein PlanApo für diese Wellenlänge zu nehmen (160mm Tubuslänge). Allein die Anzahl der Linsen und Kittflächen schreckt mich schon ab. Die Transmission bei 365nm ist bei diesen Objektiven sehr unterschiedlich. Dazu kann noch kommen, dass die Linsen oder Kittflächen fluoreszieren!
Ich nehme oft und gerne Leitz FLUOTARE, aber auch ein CZJ Apo 40/0,95 geht sehr gut, kein PlanApo !

Gruß
Peter

[reblaus]

Hallo -

auf diesem Gebiet hilft nur ausprobieren! Die Diskussion über historische Kitte, Glassorten, Fluorite etc. iat theoretisch interessant aber praktisch von geringem Wert.

Mein Planapo 40/0,9 0,11-0,23 ist bei 365 nm z.B. besser als ein Neo, während das Planapo 40/1,0 Öl mit UV praktisch gar keine Fluoreszenz liefert (Auflichtkondensor IV FL) und auch das trockene PlanNeofluar 63 1,0 eher schwach ist.

Auch Planapo 10 und 100 sind praktisch undurchlässig, hingegen kann man das Planapo 4 noch verwenden!

Gruß

Rolf

[reblaus]

Hallo -

meine Erinnerung hat Lücken und ich habs nochmal mit einer  UV LED 365 getestet - und muss mich korrigieren:

Das Planapo 10 ist mindestens so gut wie das Neo 6,3, die Fluoreszenzs (gefühlt) doppelt so hell wie das Neo 10 (!!!),  hingegen ist das Planapo 4 untauglich - nicht das was man erwarten würde!


Gruß

Rolf

[hinrich husemann]

Hallo Auflichtfluoreszenzler,
die physikalischen (d.h. meßbaren) Bildhelligkeiten sind -gleiche Beleuchtung vorausgesetzt- bezüglich der rein geometrischen Einflussgrößen Numerische Apertur des Objektivs NA und Abbildungsmaßstab oder Gesamtvergrößerung M  proportional  zu   NA⁴ / M² .
Was hierbei nicht berücksichtigt wird, ist die Transmission T der Objektivoptik, die ebenfalls als Faktor eingeht. Insbesondere im kurzwelligen Anregungsbereich treten, bedingt durch die unterschiedlichen Transmissionseigenschaften der jeweils verwendeten Glassorten, große Unterschiede auf, die sich dann in der Helligkeit des Fluoreszenzbildes stark bemerkbar machen.
Dazu noch: Die von uns subjektiv empfundenen Bildhelligkeiten sind nicht direkt proportional - d.h. linear - zu den physikalisch meßbaren Bildhelligkeiten; eine Verdoppelung der Letzteren empfinden wir nicht doppelt so hell.
Auf spezielle Fluoreszenz-Objektive hat Herr Jülich hingewiesen. Zum Beispiel ist -rein geometrisch! - unter sonst gleichen Bedingungen bei einem 40/1,25 die Bildhelligkeit  physikalisch knapp 8X mal höher als bei einem 40/0,75 und etwa 37X als bei einem 4/0,16 . Nach der sogenannten Stevens`schen Potenzfunktion (so sie denn hier anwendbar ist)  - wahrgenommene Helligkeit ist proportional zu (physikalische Helligkeit)^0,33 -  würden wir das subjektiv aber nur als etwa 2x bzw. 3,3X heller empfinden (hoffentlich habe ich mich "auf die Schnelle" nicht verrechnet. Wobei ich außerdem Schwierigkeiten hätte, ein Bild als genau 3,3x heller als ein anderes zu empfinden.).
Fluoreszenzfreundliche Mikrogrüsse
H. Husemann

[chishoro]

Vielen Dank für die Vorschlage.

Wollte bei dieser Rechnung eigentlich darauf hinaus dass sich bei der Auflichtfluoreszens auf jeden Fall lohnt auf die höhere numerische Apertur auf Kosten der Transmission zu setzen bis - ausgegangen von der Gleichung x^4*K = y^4*P für den Vergleich von 2 Objektiven und ihrer Transmission auch gilt dass x^4/y^4 = P/K - also dass der Quotient der Transmission auch dem Quotienten der NA in der 4ten Potenz entspricht.

Wie ist die Situation jetzt bei älteren Objektiven der Firma Zeiss resp. auch anderer Anbieter - ist es wirklich so, dass in der Praxis die selbe Baureihe unterschiedlicher Generation resp. Vergrößerung im nahen UV Bereich ganz erheblich in der Transmission schwanken können ?

Zeiss erwähnt eher vage Neofluare und Plan-neofluare als fuer die Fluoreszens "geeignete" Objektive - in Schrifften der 80er Jahre.

Muss man dass jeweils systematische ausmessen ?

                 Gruß,

                         Rory

[reblaus]

Hallo Rory -

das ist richtig erkannt: Zeiss erwähnt "vage" und man kann daraus gar nicht ableiten, dass z.B. das trockene Planapo 40/0,90 sich bei 365 nm so viel besser schlägt als ein ähnliches PlanNeo! Bei Blaulicht tun's alle.

Gruß

Rolf

[hinrich husemann]

Hallo,
der Ansatz   x^4 * K  =  y^4 * P  beim Vergleich zweier Objektive gleicher Vergrößerung geht - so habe ich ihn jedenfalls verstanden - von gleicher resultierender Bildhelligkeit aus. Gleiche Bildhelligkeit ist aber (natürlich gleiche Beleuchtung vorausgesetzt) i.A. gar nicht gegeben! Nur für diesen Zu-Fall  würde er gelten. Die Transmissionsgrade K und P sind unabhängig voneinander und i.A. unterschiedlich abhängig von der Wellenlänge. Insbesondere die Transmission im kurzwelligen Anregungsbereich (insbesondere UV) kann sich bei den verschiedenen Glassorten stark unterscheiden und z.T. sehr niedrig sein. Im langwelligen Bereich der Fluoreszenzstrahlung (grün, gelb, rot) sind sie in den meisten Fällen eher etwa gleich und hoch. Mit vielen Linsen unterschiedlicher Glassorten "vollgestopfte" Planapos können deshalb auch - zumindest für kurzwellige Anregungen - trotz höherer NA weniger geeignet sein als z.B. entsprechende Neos. Bei für Fluoreszenz ausgelegten Objektiven sind deshalb - zusätzlich zur höheren NA - auch die Transmissionseigenschaften der Glassorten (insbesondere im Kurzwelligen) von besonderer Bedeutung.
Abendlich fluoreszierende Mikrogrüsse
H. Husemann

[hinrich husemann]

Nur noch eine experimentelle Ergänzung:
Wenn die Transmission bei allen betrachteten Objektiven gleich wäre, würden - gleiche Beleuchtung, gleiches Filtersystem und gleiches Fluoreszenzobjekt vorausgesetzt - die physikalischen Helligkeiten (Beleuchtungsstärke) der Bildebene direkt proportional zu (NA⁴/M²) sein. Bei Messung der jeweiligen Belichtungszeit t , z.B. mit dem Meßsystem einer aufgesetzten Spiegelreflex, müsste dann das Produkt (NA⁴/M²) * t  für alle diese Objektive den gleichen Wert haben.
Als Objekt fungierte ein flächenhaftes, gleichförmiges, mit Acridinorange getränktes Sytem (das Sehfeld war durch die Fluoreszenz homogen ausgeleuchtet); Auflichtfluoreszenz am Universal mit III RS mit BP 450-490/ FT 510 /LP 520 und Halogenleuchte 100 W, aufgesetzte Kamera Olympus E-420. Gemessen wurde die Belichtungszeit t (Mittelwerte aus mehreren Messungen) für die genannten Objektive ZEISS (West)-Objektive.
Ergebnisse:
                   Objektiv                     (NA⁴/M²)               t/s                       (NA⁴/M²) * t

             Planapo 10/0,32               10,5 * 10^-5             0,625                    6,56 * 10^-5
             Neofluar 10/0,30                8,1 * 10^-5             0,40                      3,24 * 10^-5
             Neofluar 6,3/0,20               4,0 * 10^-5             0,77                      3,08 * 10^-5
             Planapo 4/0,16                  4,1 * 10^-5             1,5                        6,15 * 10^-5

Natürlich muß man hier einige Meßungenauigkeiten tolerieren. Dennoch zeigt sich aus diesen Zahlenwerten, daß auch schon bei Blau-Anregung die Neos offenbar hellere Bilder liefern als die mit etwas höheren Aperturen versehenen Planapos. Bei Letzteren mußte im Verhältnis etwa um einen Faktor 2 länger belichtet werden !

Fluoreszenzfreundliche Mikrogrüsse
H. Husemann
               

[Werner Jülich]

Hallo Herr Husemann,
Ihr kleines Experiment zeigt, was zu erwarten war und z.B. bei Dapi noch weitaus heftiger ausgefallen wäre.
Da trifft es sich doch ganz gut, dass Zeiss die Transmissionskurven der aktuellen Objektive zur Verfügung stellt.

Werner Jülich

[hinrich husemann]

Nur noch ein kleiner "Nachschlag" zu den obigen Experimenten (wieder gleiche Bedingungen):

Objektiv                        (NA⁴/M²                t/s          (NA⁴/M²) * t
Planapo 25/0,65 PH2      28,6 * 10^-5             1/4         7,15 * 10^-5
Neofluar 25/0,60 PH2     20,7 * 10^-5             1/5         4,14 * 10^-5
Neofluar 40/0,75 PH2     19,8 * 10^-5             1/5         3,96 * 10^-5
Neofluar 40/0,75              "         "              1/6           3,3 * 10^-5
Neofluar 16/0,40            10,0 * 10^-5            1/3         3,33 * 10^-5

Auch hier ist das Neo 25/0,60 PH2 fluoreszenzmäßig etwas "heller" als das etwas höheraperturige Planapo 25/0,65 PH2 ; gleichfalls erkennt man an den beiden 40iger Neos den etwas transmissionsmindernden Einfluß der PH-Ringe sowie allgemein die relativ einheitlichen, guten Transmissionseigenschaften der anderen Neos.
Drittadventlich vorauseilende Mikrogrüsse
H. Husemann

[chishoro]

Vielen Dank fürs Experiment & die interessanten Zahlenwerte.

Wie wurden denn die Belichtungszeiten ermittelt - einfach durch Ablesen des Vorschlages der Kamera oder in dem mehrere Bilder gemacht wurden ?

Gerade in monochromatischem Fluoreszenslicht resp. bei niedriger Leuchtstaerke sind die von einem einfachen Beleuchtungsmesser vorgeschlagenen Werte nicht immer sehr zuverlässig.

Weiter würde mich bei diesem Experiment interessieren, wie sich die Planachromate schlagen - vermutlich deutlich schlechter als die Neofluare aber der Vergleich dürfte gleichwohl interessant sein - die Transmission dürfte im Vergleich mit den Planapos auf Grund der geringeren Linsenzahl etwas besser sein - außerdem wäre das Bild plan.

Als Nachtrag noch zu der Gleichung x^4*K = y^4*P - gemeint war da nicht das es irgendwo Objektive x und y gibt die trotz unterschiedlicher N.A. genau den richtigen Transmissionsgrad habe so dass die Gleichung stimmt - mehr so als Anhaltspunkt zum Thema optimieren - z.B. dass die Transmissionsgrad vom Neofluar 10 mit N.A. 0.30 bei gegebener Anregung erheblich schlechter sein sein muss bis sich z.B. der Einsatz eines Ultrafluares mit N.A. von 0.20 lohnt.

                       Gruß,

                               Rory

[reblaus]

Hallo Rory -
wie Herr Jülich schon andeutete - die Blaulichtuntersuchung ist nicht sehr aussagekräftig. Interessant wird es wirklich erst bei UV, d.h. 365 nm und da gibt es krasse Unterschiede innerhalb der gleichen Objektivreihe:
Wie oben erwähnt ist das Planapo 40 0,95 (trocken) weit heller als die vergleichbaren Neofluare, während das Planapo 40 Öl für UV praktisch blind ist, ebenso das 63 und das 100 Öl.
Gruß
Rolf