Schichtdicke / arbeiten mit Ölimmersion

[G. Helbig]

Hallo zusammen,

bisher habe ich mich weitgehend mit großen Objekten und niedrigen Vergrößerungen beschäftigt. Mit Objektiven mit Ölimmersion bin ich somit nicht routiniert. Zwei Probleme treten immer wieder auf:

- wenn die Schichtdicke zwischen Objektträger und Deckglas noch zu groß ist, verschiebt das Objektiv mit dem Immersionsöl das Deckglas bei der Betätigung des Kreuzstisches.

- wenn die optimale und somit minimale Schichtdicke durch Verdunstung erreicht ist, dann habe ich weniger als 5 min Zeit bevor das Wasser soweit verdunstet ist, daß alle Objekte geplatzt sind. Auch werden sie innerhalb dieser Zeit deformiert und entsprechen nicht mehr der natürlichen Form. Ein Wassertropfen an die Seite des Deckglases bringt keine Abhilfe.

Gibt es hierfür Tricks zur besseren Handhabung?

Hier noch ein Beispielbild: die kleinere Blutregenalge hat noch eine weitgehende ovale, natürliche Form, wärend die große Alge schon gedrückt wird und an ihre Außenhülle stößt.


63x, DIC, EOS 550

viele Grüße

Gerald

[treinisch]

Hallo Gerald,

ich bin sehr gespannt auf die Antworten der Profis.

Ich helfe mir, in dem ich entweder etwas Methylcellulose am
Rand unter das Deckglas gebe (nicht in die Probe, so bleibt die
natürliche Form erhalten). Das verschafft deutlich mehr Zeit bis
zum Zerquetschen. Vaseline habe ich auch schon ausprobiert, ich finde
die geht auch gut, aber Methylcellulose macht weniger Schmiererei.

Oder ich klebe das Deckgläschen mit winzigen Tröpfchen Gummi Arabicum
an den Ecken auf dem Objektträger fest. Solche winzigen Tröpfchen sind nach
etwa 1 Min richtig fest und lassen sich natürlich später mit Wasser wieder
entfernen oder mit einer Präpariernadel wegkratzen.

Viele liebe Grüße
Timm

[steffenclauss]

Hallo Gerald,

mit der Problematik kämpfe ich auch des öfteren. Der Balanceakt zwischen optimaler Auflösung und noch unbelasteten Objekt ist oft schwierig. Vor allem bei div. Ciliaten welche ungemein empfindlich auf Deckglasdruck reagieren kann man Nerven lassen.

Für mich hat sich am besten die Verwendung größerer Deckgläser (24x50) bewährt. Auch kann man Vaselinepunkte an den Enden kleiner DG legen und durch vorsichtiges Niederdrücken (mit abgeflachten Zahnstocher) die optimale Schichtdicke einstellen. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung niedrigviskoser Immersionsmedien.
Seit ein paar Jahren nutze ich ein Merk-Immersionsöl mit einer Viscosität (dyn) von 100-120 mPas, also ähnlich wie Salatöl und komme gut klar damit.

viele Grüße
Steffen

[Rene]

Scotch tape and a large coverglass works quite well, you can make microaquaria and such. (one layer is 50 thick). Generally I let the cover slip resting on one layer of tape on one side, then tape it like you would with a loose book  page. Works quite well with oil immersion.
Vasilin feet are the victorean choice however, tap it with a needle until your cells are fixed but not compressed.
Must try out the gummi and methycellulose trick of Timm, but I am not sure how well you can control the thickness.

Best wishes, Rene

[steffenclauss]

Hallo Timm,

stimmt Methylcellulose, hier nicht als Bewegungsbremse sondern für die höheren Schichtdicken, ist gut geeignet.

viele Grüße
Steffen

[Eckhard]

Hallo Gerald,

ich kämpfe mit den gleichen Problemen.

Bei grossen Deckgläsern (24x50) wird das Deckglas nicht verschoben bevor die optimale Schichtdicke erreicht ist. Auch hast Du fast 15 Minuten Zeit, bevor alles zerquetscht wird.

Mit der Deformation der Zellen wirst Du leben müssen.

Herzliche Grüsse
Eckhard

[Bernd]

Hallo Gerald,

- wenn die Schichtdicke zwischen Objektträger und Deckglas noch zu groß ist, verschiebt das Objektiv mit dem Immersionsöl das Deckglas bei der Betätigung des Kreuzstisches.

das Problem kannst du vermeiden, indem du ein Immersionsöl mit niedriger Viskosität verwendest.

- wenn die optimale und somit minimale Schichtdicke durch Verdunstung erreicht ist, dann habe ich weniger als 5 min Zeit bevor das Wasser soweit verdunstet ist, daß alle Objekte geplatzt sind. Auch werden sie innerhalb dieser Zeit deformiert und entsprechen nicht mehr der natürlichen Form. Ein Wassertropfen an die Seite des Deckglases bringt keine Abhilfe.

Für dieses Problem weiß ich auch keine Lösung. Die Auflösung wird nun mal um so besser, je geringer die Schichtdicke ist. Manchmal, z. B. bei Ciliaten,  ist das ja auch hilfreich, weil man erst bei gequtschten Tieren bestimmte Details erkennen kann. Oft werden aber auch Strukturen bis zur Unkenntlichkeit plattgedrückt. Da hilft nur, während des Quetschvorgangs mehrere Fotos machen und hinterher das beste aussuchen. Mit irgendwelchen Unterlagen unter dem Deckglas habe ich bisher nur selten gute Erfahrungen gemacht. Entweder ist die Schichtdicke zu groß und bleibt auch zu groß, oder die Unterlage federt zurück (z.B. Vaseline) oder beim Versuch, die Schichtdicke zu verringern, wird das Objekt zerquetscht.

Viele Grüße
Bernd

[beamish]

Hallo Bernd,

das kann ich bestätigen! Als Pilzler mokroskopiere ich ja fast nur unter Öl. Da gibt es riesen Unterschiede! Ich hab mir jetzt mal 3 verschiedene Fläschen aus meinem Fundus hingestellt:
1. unbekannter Hersteller/Vertreiber (irgendwann mal von ebay), Plastikflasche (geschätzte 25-30 ml) . Beschriftung: "Immersionsöl/Canadabalsam, Für die Mikroskopie, Aussehen: Klares gelbes bis dunkelgelbes Öl, Dichte (20° C): 0,985-0,998, Brechungsindex (20°): 1,510-1,525"
Meine Erfahrung: sehr zäh, klebrig und sehr dunkel.
2. Immersionsöl, Vertreiber Windaus, Glasflasche (25ml), keine Angaben zum Brechungsindex. Meine Erfahrung: schon dünnflüssiger und heller. Hab ich gerne benutzt bevor ich das nächste kennen lernte:
3. Microscope Immersion Oil - Low Viscosity, "Resolve", Hersteller/Verteiber: Richard-Allan Scientific, Brechungsindex (23°) 1.5150, Plastikpatrone mit Tropfspitze (15 ml). Meine Erfahrung: das am wenigsten klebrige, klare und dünnflüssigste Immersionsöl, das ich bisher hatte.

Es lohnt sich durchaus, verschiedene Öle auszuprobieren...

Herzlich

Martin

[Michael Plewka]

hallo zusammen, hallo Herr Helbig,

die Erfahrungen, die die Kollegen mit der Ölimmersion gemacht haben, kann ich im wesentlichen bestätigen. Im Zusammenhang mit ihrer Anfrage zu dem Vergleich der Objektive 63x vs. 100x stellt sich mir nun aber wieder dieselbe Frage: Sind für die Tümpler-Anforderungen (und darum scheint es sich hier ja zu drehen) die "normalen" Planapochromaten überhaupt die richtige Wahl?
Im Gegensatz zu den im "63x vs. 100x" gezeigten Bildbeispielen (histologische Präparate), die eine definierte und auf die Anforderungen der Planapos optimierte Dicke haben, hat der Tümpler, so wie  auch in den in diesem Thread gezeigten Beispiele, es eben mit anderen Proben und damit Problemen  zu tun.
Aus dem "Objektive" Katalog der Fa. Zeiss kann man entnehmen, dass die Sphärische Aberration  im Bereich der Tümplerei eigentlich das größte alltägliche Problem bei starken Vergrößerungen darstellt. Lt. diesem Katalog kann die Sphärische Aberration mit Objektiven , die einen Korrekturring besitzen, kompensiert werden. Ich interpretiere das so, dass ich (wenn auch in Grenzen) in die Probe durch die Wasser/Zellplasmaschicht hindurchfokussieren kann und dennoch ein vergleichsweise kontrastreiches Bild erhalte.  Lediglich von dem Zeiss Planapo 40/ 0,95 als  Trockenobjektiv kann ich aus eigener Erfahrung berichten, dass dieser Korrekturring sehr wohl Einfluss auf Auflösung und Kontrast hat, allein ich habe kein Vergleichsobjektiv..

Deshalb laufen ihre  2 Fragen nach meiner Meinung auf eine hinaus: lässt sich mit einem C-Apochromat (d.h. mit Korrektur für Sphärische Aberration) bei eher ungünstiger Schichtdicke ein  kontrastreicheres und  besser aufgelöstes Bild als mit "normalen" PlanApochromaten erreichen? Mich würde interessieren, ob diesbezüglich jemand konkrete Erfahrungen hat (nicht wieder "müsste" , "dürfte" oder "könnte sein")

beste Grüße Michael Plewka

[Piper]

Hallo,

ich kann auf die Frage von Michael Plewka zumindest eine konkrete indirekte Antwort geben, die sich auf Leitz-Objektive bezieht, jedoch in die selbe Richtung weist:

Es war seinerzeit in "eingeweihten Kreisen" bekannt, akzeptiert und wurde auch von Leitz-Technikern (zumindest hinter verschlossener Tür) so bestätigt, dass die damaligen einfacher konstruierten Planachromate (Serie NPL) bzw. Plan-Halbapochromate (Serie NPL Fluotar) kontrastreicher zeichneten als die entsprechenden Planapochromate. Auch wurde eingeräumt, dass die nicht-apochromatischen Optiken hinsichtlich der Konturschärfe bzw. des visuellen Schärfeeindruckes die "besseren" (=schärfer wirkenden) Bilder lieferten. Dies galt in jedem Fall für Hellfeld-Objektive ohne Phasenring. Folgerichtig wurden für native Lebendbeobachtungen, aber auch für Beobachtungen gefärbter Präparate diese Optiken für "Allround-Anwendungen" explizit empfohlen und den Planapochromatien vorgezogen, und zwar unabhängig von der Schichtdicke. Das einzige Argument für die damaligen planpapochromatischen Hellfeld-Objektive war eine höhere Farbsättigung und visuell angedeutet erahnbare höhere Farbreinheit. Damaliges Zitat: Kann bei bestimmten farbigen Objekten vielleicht in der Farbmikrofotografie von Vorteil sein, ist aber für die Boebachtung selbst nahezu irrelevant.

Ich hatte damals die Gelegenheit, von allen gängigen Vergrößerungsstufen die entsprechenden Objektive der vorgenannten Serien im direkten Vergleich zu testen und auch Test-Farbdias zu erstellen, welche in großformatiger Projektion einem Vergleich unterzogen wurden. Fazit war: Die Nicht-Planapochromate waren nicht nur bei der Beobachtung "knackiger", sondern auch die Dias zeigten tatsächlich eine höhere Konturschärfe im projizierten Bild.
Gänzlich anders verhielt es sich bei Phasenkontrastobjektiven. Hier waren die Planapochromaten durchweg sichtbar (!) überlegen.

Damalige Konsequenz aller Tests: Die Hellfeld-Objektivserie wurde aus NPL und NPL-Fluotar-Objektiven zusammengestellt, die Phasenkontrast-Serie aus Planapochromaten.
Ergänzende Anmerkung: Natürlich waren die NPL Objektive im Hellfeld auch sichtbar besser als die Phasenkontrast- Planapochromaten im Hellfeld.

"Wahrscheinlich" oder "möglicherweise" (pardon für diese unklaren Vokabeln ) könnten sich diese Erfahrungen auch auf entsprechende Optiken von Zeiss übertragen lassen.

Schöne Mikro-Grüße
Jörg Piper

[peter-h]

Eine Frage,

es gibt von Zeiss ein Plan Neofluar W 63/1,25 W Korr , mit einem Arbeitsabstand von 0,12mm. Also Wasser zwischen Objektiv und Deckgals. Hat schon jemand versucht dieses Objektiv ohne Deckglas zu verwenden? Durch die Korrektur "könnte" es ja noch im Endbereich der Einstellung brauchbare Bilder machen.

Viele Grüße
Peter H.

[piu58]

Ich habe noch eine Idee:
Bei uns in der Pathologie werden überhaupt keine Deckgläser benutzt. Die Präparate (gefärbte Schnitte) werden mit einer Folie abgedeckt, die ist viel dünner als Deckgläser. So in Richtung Tesafilm. Da die Deckglasdicke bei Immersion keine Rolle spielt, könnte man erwägen, mit so was einen hängenden Tropfen zu basteln, z.B. unter Hilfe eines eingschliffenen Objetträgers. Ich versuche mal rauszukriegen, was das für Folie ist.

[G. Helbig]

Hallo,

vielen Dank für die vielen Antworten. Es sind einige Tipps und Anregungen dabei, welche ich versuche umzusetzen. Die größeren Deckgläser sind schon bestellt.

@ Martin
wo beziehst Du "Microscope Immersion Oil - Low Viscosity, "Resolve", Hersteller/Verteiber: Richard-Allan Scientific"? Ich habe im Internet einen deutschen Vertrieb gefunden, doch er hat noch nicht auf meine Anfrage geantwortet.

Viele Grüße

Gerald

[beamish]

Hallo Gerald,

ich habe es von Herrn Jülich in Bonn.

Grüße

Martin

[Rene]

BTW, Cargille sells testkits with 3-4 bottles with different viscosities. They are miscible with eachother. Compared with Olympus prices, Cargille is very cheap.

HTH, Rene