Normalesmikroskop mit fluoreszenz ausstatten?

[Hyperion]

Hallo,

ich frage mich ob man ein normales 0 8 15 Mikroskop nicht irgendwie zum Fluoreszenzmikroskop umbauen könnte?

Sagen wir wr haben ein Objekt mit GFP (Emittiert bei 509 nm und absorbiert mit zwei maxima bei 395 und 475 nm).

Würde es nicht reichen einfach in den Tubus einen Filter zu legen, welcher ein Fenster bei um die 509 nm hat und mit einer Spektrallampe mit Kaltlichleiter mit entsprechender Wellenlänge anzuregen?

Mit so einem Mikroskop müsste doch auch nur die Zellen zu sehen sein die grünes Licht emittiern?

Oder gehört da noch mehr dazu?

Gruß Hyperion

[Klaus Herrmann]

Oder gehört da noch mehr dazu?

Nö eigentlich nicht. Vielleicht zur Sicherheit noch ein LP 490 davorschalten, damit nix von der Anregung durch kommt.

[Detlef Kramer]

Hallo,

das ist die klassische Durchlicht-Fluoreszenz. Dazu brauchte man früher natürlich ein schmalbandiges Anregungsfilter hinter der Lichtquelle und die Sperrfilter im Strahlengang hinter dem Objektiv, manchmal einfach auf dem Okular aufgesteckt. Die Anregung kann man heute einfach mit einer Royal-Blue LED reagieren.

Detlef

[peter-h]

Hier mal ein Schnellschuß 

absolut nicht optimal, es geht besser. Aber auch in der ganz einfachen Version kann man Fluoreszenzaufnahmen machen.


Christrose , Etzold grün
Weisse 3 Watt LED mit Blaufilter BG12 , Sperrfilter einfaches Gelbfilter GG495 , Kamera DFK72 , Nachbearbeitung in PaintShopPro. Kosten für Filter ?

Grüße
Peter H.

[Hyperion]

Oh, ich habe nicht gewusst, dass es SO einfach ist...

[Eckhard]

Hallo,

es geht sogar noch einfacher:

Unterhalb des Kondensors ein Polarisator, oberhalb der Objektive ein Analysator. Polarisator und Analysator in Kreuzstellung bringen, so dass eine möglichst perfekte Blockade des Lichtes erreicht wird. Nun den Kondensor in Dunkelfeldposition bringen.

Das Ergebnis ist eine Durchlichtfluoreszenzeinrichtung. Mit einer hinreichend starken Beleuchtung (Beispiel unten 50W Halogen) hat man Anregungslicht über das gesamte Spektrum und einen Sperrfilter, der das gesamte Anregungslicht auslöscht.


10x EC Plan Neofluar, Rotalge mit Autofluoreszenz des Chlorophylls 

Herzliche Grüsse
Eckhard

[Klaus Herrmann]

Hallo Eckhard,

diese Anordnung zur Fluoreszenz verstehe ich nicht. So wie Du es beschreibst ist das Durchlicht-Pol kombiniert mit Durchlicht Dunkelfeld.
Wieso soll das zur Fluoreszenzbeobachtung geeignet sein?

Fluoreszenz setzt voraus: ein Materie, die zur Fluoreszenz geeignet ist (bei niedriger Wellenlänge Strahlung zu absorbieren und bei nach höherer Wellenlänge verschoben wieder zu emittieren)
Dafür benötigt man eine möglichst nach oben begrenzte Anregung und ein Sperrfilter, dass die Emision durchlässt, aber die Anregungswellenlänge sperrt.

Man kann die DL-Fluoreszenz wie von Peter beschrieben machen und den Kontrast noch verbessern durch zusätzliches DF
Beispiel dafür: Ein Präparat von Robin Wacker. Im Durchlicht DF mit 100W Halogen und einem Kristallviolett-Filter als Anregungsfilter und einem LP 500 als Sperrfilter. Ohne DF gibt es Überstrahlungen.

[reblaus]

Hallo Klaus -

warum zweifelst du?

Der Trick ist doch wirklich gut: Anregungslicht kommt wegen der gekreuzten Polfilter nicht durch - wohl aber das rote Fluoreszenzlicht des Chlorophylls, das ja nicht polarisiert ist.
Einschränkung ist natürlich, dass doppeltbrechende Strukturen Fluoreszenz vortäuschen/überlagern können.

Viele Grüße

Rolf

[Hyperion]

Oh das klingt aber interessant!!!

Analysator und Polarisator hätte ist da, was heisst Kondensor in Dunkelfeldstellung bringen?

[Klaus Herrmann]

Hallo Rolf,

das ist eine sehr unkonventionelle Betrachtungsweise:

Einschränkung ist natürlich, dass doppeltbrechende Strukturen Fluoreszenz vortäuschen/überlagern können.

bedeutet alle Polbetrachtungen bei gekreuzten Polarisatoren sind eigentlich Fluoreszenzen? Polmikroskope sind somit auch Fluoreszenzmikroskope?

Ich würde mal sagen, dass die Einschränkung vorherrschend ist!

[hinrich husemann]

Hallo Polfluoreszierende,
das beschriebene Verfahren zur "Polfluoreszenz" hat neben der schon erwähnten, nicht zu unterschätzenden "Verunsicherung" durch doppelbrechende Objekte außerdem den Nachteil, daß auch das nichtpolarisierte(!) Fluoreszenzlicht beim Durchgang durch den Analysator merklich geschwächt wird; es kommt davon bestenfalls in der Größenordnung von ca. 30 % hindurch. Im Gegensatz dazu versucht man in der Fluoreszenzmikroskopie ja allgemein, Helligkeits-Verluste - insbesondere bei Fluoreszenzen geringer Intensität - zu vermeiden, indem man Objektive möglichst großer Numerischer Apertur, nicht zu hoher Vergrößerungen und hoher Transmission einsetzt. Es ist sicher ein ganz interessanter "Gag"; als wirklich brauchbares Mikroskopie-Verfahren ist es - wie Herr Herrmann schon sagt - wohl kaum zu betrachten.
Fluoreszenzfreundliche Mikrogrüsse
H. Husemann

[reblaus]

Hallo Klaus -

dann hier die Version für Polmikroskopiker mit streng wissenschaftlicher Herangehensweise:

Achtung! Vor der Veröffentlichung von Messdaten ist durch ein Kontrollexperiment nachzuweisen, dass die postulierte Doppelbrechung nicht in Wirklichkeit durch Fluoreszenz vorgetäuscht oder verfälscht ist 

Gruß

Rolf

[Eckhard]

Hallo,

Einschränkung ist natürlich, dass doppeltbrechende Strukturen Fluoreszenz vortäuschen/überlagern können.

Ja, das stimmt - wobei die Einschränkung sich im praktischen Gebrauch als hilfreich erweist, wie im unten gezeigten Beispiel, wo Grünalgen und Cyanobakterien sauber differenziert werden.


10x EC Plan Neofluar, Grünalge mt aufsitzenden Cyanobakterien

Natürlich kann dieses Verfahren nicht in Konkurrenz zu kommerziellen Fluoreszenzlösungen stehen: neben dem von Herrn Husemann erwähnten Verlust von Fluoreszenzlicht durch den Analysator wird die Probe von unten angeregt und von oben betrachtet. Dabei treten weitere Verluste von Anregungslicht bzw. Fluoreszenzlicht auf. Kommerzielle Lösungen gehen daher über eine Auflichtanregung. Deshalb ist das vorgestellte Verfahren für die professionelle Arbeit mit Fluorochromen ungeeignet. Aber für erste Experimente reicht es vollkommen aus - gerade die Autofluoreszenz des Chlorophylls lässt sich sehr gut beobachten. Ob man das als Gag betrachtet, muss jeder für sich selbst entscheiden.

Die Eingangsfrage dieses Threads war, ob sich ein Normalmikroskop mit einfachen Mitteln umbauen lässt, um Fluoreszenz zu beobachten. Darauf habe ich eine Antwort gegeben und eine Lösung vorgestellt.

Herzliche Grüsse
Eckhard

[Klaus Herrmann]

Achtung! Vor der Veröffentlichung von Messdaten ist durch ein Kontrollexperiment nachzuweisen, dass die postulierte Doppelbrechung nicht in Wirklichkeit durch Fluoreszenz vorgetäuscht oder verfälscht ist 

Fehlt noch der Nachsatz: wer es dennoch tut zahlt 2 Mark und fließt in die Gemeindekasse

[Klaus Herrmann]

gerade die Autofluoreszenz des Chlorophylls lässt sich sehr gut beobachten. Ob man das als Gag betrachtet, muss jeder für sich selbst entscheiden.

Schönes Bild! Was ich mich allerdings frage: Das Chlorophyll emittiert eigentlich im Roten:

Wird die Fluoreszenz spektral aufgelöst, so kann man aus dem gemessenen Fluoreszenz-Emissionsspektrum auf die Farbstoffzusammensetzung einer Probe schließen. Die Fluoreszenz des Chlorophylls liegt zwischen 650 und 800 nm mit Maxima bei 690 nm (dunkelrot) und 740 nm (nahes infrarot

Haben wir es dann hier mit Fluoreszenz zu tun? Und das war doch die Frage?

Ich habe schon viele Aufnahmen im polarisierten Durchlicht von Pflanzenzellen mit Chloroplasten gemacht, dabei aber noch nie "Rot gesehen"

Auf dem Bild, das als Beleg gezeigt wird sind die Chloroplasten der Grünalge doch grün!

In meinem Bild haben wir die Rotfluoreszenz von Chlorophyll am Beispiel von Algen:Nicht gerade scharf, aber rot!