GFP Fusionsprotein in Mesophyllprotoplasten

[Hyperion]

Green Fluorescent Protein fusioniert mit einem Transporter (genaueres darf ich nicht sagen) in Arabidopsis Mesophyllprotoplasten (=Pflanzenzellen OHNE Zellwand).

Aufgenommen mit einem Leica TCS

40x Fach Ölimmersion

30 Aufnahmen gestackt, Average 1, Line Average 1, Blur Filter durch Leica Software.

Overlay des GFP und Chloroplastenautofluoreszenzkanals. ( Anmerkung die Detektoren sind Wellenlängen- / Farbenblind! --> Die Farben auf dem Bild sind Falschfarben durch den Computer!)

Man sieht sehr schön das das Protein in der Plasmamembran lokalisiert ist, ein wenig befindet sich noch im Endoplasmatischen Retikulum (fädiges Zeug in der Mitte).

Ausserdem kann man Thylakoidstapel in den Chloroplasten erahnen.

[Rene]

Wow, spooky. The chloroplasts appear dotted, is that what you mean?

Happy Eastern, Rene

[Hyperion]

Yes, I've been told that this dots are staples of the thylakoid membrane...

By the way, isolation protoplasts is very boring. You have to fill a glass plate (30 cm in diameter) with tiny little arabidopsis leafs for digestion. After that you have to handel them very slowly and carefully (for example centrifugation withoput  brake) in order to avoid disintegration.

You can also do a lot of other funny things with protoplasts. For example producing a tomoffel:

http://2.bp.blogspot.com/_kMwxwb1UG5E/SXT5ASfKO8I/AAAAAAAAAAM/HR6HDDqHyjw/s1600-h/Tomoffel.gif

[Hyperion]

Na soviele Views und keiner hat was zu sagen.... Konfokalbilder Kommen wohl nicht so gut an  

Hier noch ein paar andere Bilder.

Das wurde auch gestackt, ist aber keine so schöne Aufnahme geworden da die Zelle schon kurz vorm verrecken war. Man erkennt das daran das die Vakuole aufgrund von Streß zu fluoreszieren beginnt.  Wie ich schon erwähnte sind die Detektoren farbenblind, daher werden diese Stellen auch grün gezeichnent wenn die Emmision in den eingestellten Spektralbereich fällt. In der Vakuole ist hier natürlich KEIN GFP.

Der "Ring" im Bild kommt dadurch zustande, dass die Protoplasten von unten am Deckglas pappen und soz. ein wenig abgeflacht werden.

Jedoch sieht man hier den Transport des Proteins über den sekretorischen Pathway sehr schön (ER --> Golgi --> Plasmembran), daher zeige ich es trotzdem (soz. pädagogisch wertvoll), zum publizieren würde man natürlich ein besseres Bild nehmen.

Die hellen Punkte im inneren sind Golgivesikel die zur Plasmembran wandern.

Ich poste darunter auch noch 3 Aufnahmen vom gleichen Protoplasten, nur ein einziger Schnitt kein Stack, aber hier zeige ich mal alle drei Kanäle.

1. GFP
2. Chloroplasten Autofluorescenz
3. Normanski DIC (Keine Ahnung warum das so aussieht, aber laut Leica gehört das so. Vielleicht liegts am schwarz weiss?)

Sehr schön sieht man das es sich um Konfokal und NICHT und Fluoreszenzaufnahmen handeln muss. Denn im DIC sieht man viel Chloroplasten die in dem Fluoreszenzbild gar nicht vorkommen (liegen eben nicht in der richtigen Z Ebene). Bei einem normalen Fluoreszenzmikroskop wäre so eine Unterscheidung nicht möglich und die Fluoreszenz aus den anderen Ebenen würde im Bildhintergrund zu sehen sein (und das Bild wäre viel verschwommenener und unschärfer).

[7an]

Ich finde die Fotos sehr intressant. Welches Protein ist markiert?
Zellwand neusynthese?

[Hyperion]

Ein Monosaccharid / Polyol Transporter, genauer ein sekundäraktiver Symporter der diese Stoffe über einen Protonengradienten in die Zelle importiert.

Welcher genau darf ich nicht sagen, die Sachen sind noch nicht veröffentlicht.

[Eckhard]

Hallo,

Ich würde ja gerne etwas sagen, aber dazu müsste ich die Bilder sehen. Ich sehe nur einen Eiswuerfel mit einem unglücklichen Frosch darin und den Titel "Domain Unregistered. To view, register at bit.ly/imageshack-domain"

Herzliche Grüsse
Eckhard

[Peter V.]

Hallo!

Na soviele Views und keiner hat was zu sagen.... Konfokalbilder Kommen wohl nicht so gut an  

Na ja, Dominik, das hat ja auch nicht allzu viel mit klassischer Mikroskopie zu tun. Es ist halt eine Funtkionsuntersuchung. Nur die Wenigsten von uns haben ein Konfokalmikroskop zuhause, insofern hält sich wohl die Erfahrung der meisten Forummmitglieder mit dieser Methode in Grenzen. Und wer soll über was diskutieren, wenn doch alles so geheim ist?  


Herzliche Ostergrüße
Peter

[Peter Herkenrath]

Hallo Hyperion,

die wenigsten hier können Fuoreszenzaufnahmen flüssig interpretieren, und ein Konfokales Laserscanning-Mikroskop hat sowieso keiner. Bei dem oben gezeigten Bild bin ich nicht einmal sicher, ob es wirklich eine Zelle zeigt oder nur den kreisrunden Bildausschnitt einer schlecht angepassten Mikroskopkamera. Da müsste schon eine ausführliche Beschriftung her, mit Pfeilen, die auf die Strukturen zeigen.

Gruß, Peter

[Hyperion]

Ok gut ich verstehe, dann liefere ich nochmal einiges an Erklärung nach!

GFP = Green Fluorescent Protein. Dabei handelt es sich um ein Protein aus der Qualle Aequorea victoria. Bei Anregung im UV Licht leuchet es und sendet grünes Fluoreszenzlicht aus.

Chlorophyll ist der Farbstoff aus den Chloroplasten, wenn man ihn mit UV Licht anregt, dann fluoresziert er rot.

Ein Konfokalmikroskop ist so etwas wie ein Fluoreszenzmikroskop, nur mit dem Unterschied, dass die Anregung nicht durch eine Lampe sondern durch einen Laser erfolgt. Der Laser fokusiert immer nur 1 Punkt in XY Richtung und tastet dann das Objekt von links nach rechts und oben nach unten ab. Von jedem Punkt den der Laser anregt wird die Fluoreszenz gemessen und das Bild dann wie bei einem alten Röhrenfernseher Punkt für Punkt und Zeile für Zeile aufgebaut. Das Bild wird umso besser je öfter ich das ganze Abtaste.
Line average = 1 heißt Jede Zeile 1 mal und Average = 1 heiß jedeses Bild 1 mal abtasten. Höhere werte machen ein besseres Bild aber dafür dauert es dann länger. Wenn sich das Objekt zwischendrin bewegt war alles für die Katz. Deshalb nimmt man zum Stacken niedrigere Werte als wenn man nur einen einzigen Schnitt macht.

Der nächste wesentliche Unterschied ist der, dass durch die eine Blende nur das Fluoreszenzlicht im Strahlengang verbleibt, welches in der Fokusebene liegt. Fluorezenzlicht aus darunter oder darüber liegendenen Ebenen wird blockiert.Die Kombination dieser beiden Punkte erlaubt eine viel höhere Auflösung und viel bessere Bilder als mit normalen Fluoreszenzmikroskopen.

Das richtige Licht wird dann über Bauelemente im Mikroskop in Wellenlängen(bereiche) aufgespalten und diese auf die Detektoren gelenkt. Die Detektoren können nur Intensitäten messen (sind also Farbenblind) und keine Wellenlängen untscheiden. Welche Wellenlängenbereiche nun auf die Detektoren treffen sollen wird per Software eingestellt. Die Farbe entsteht dann am Computer in dem gesagt wird "Alles was Detektor 1 misst malst du mir grün". Man kann aber natürlich auch beliebige andere Farben einstellen. Deshalb Falschfarben.
Im Mikroskop sind mehrere Detektoren verbaut, daher rühren die einzelnen Kanäle. Das fertige Bild entsteht dann durch überlagerung aller Kanäle.

Protoplasten sind Pflanzenzellen die keine Zellwand haben. Praktisch macht man das so: Man zupft Blätter von einer Pflanze ab und raut die Unterseite ganz leicht mit feinem Sandpapier an. Dann kommen die Blässte in eine Petrischale in der sich eine Verdaulösung aus Pektinase und Cellulase befindet. Die Enzyme lösen also die Zellwand der Pflanzenzellen auf.
Wenn das weit genug geschehen ist, ploppen die Protoplasten aus den Blättern. Da die Zellwand den Pflanzen auch ihre Form gibt, nehmen sie ohne Zellwand eine Kugelgestalt an.

Wie alle Wissen sind Pflanzenzellen innen von einer riesigen Vakuole ausgefüllt. Man kann sich das bildlich so vorstellen: Nehmt zwei Luftballons, einen großen und einen etwas kleineren und steckt den kleineren in den größeren.
In den Zwischenraum zwischen den beiden Ballons gebt ihr eine handvoll Smarties. Nun blast den kleinen Luftballon auf und ihr bekommt eine Kugelgestalt in der die Smarties zwischen den beiden Luftballos eingequetscht sind.

Der kleine Luftballon steht für die Vakuole und dessen Membran, der große Luftballon für die Zelle und die Plasmamebran. Die Smarties sind die Chloroplasten die sich genau dazwischen befinden. Dieser winzig kleine Zwischenruam zwischen den beiden Ballon ist das Cytosol. Nur in diesem Bereich befindet sich der gesamte Rest der Zelle, Chloroplasten, der Zellkern, die Mitochondrien, das Endroplasmatische Reticulum, der Golgiapparat und noch ein paar andere Dinge.

Das Protoplastenmodell eignet sich sehr schön wenn man wissen will wo ein Membranprotein nun genau in der Zelle sitzt. Dazu fusioniert man die Sequenz des Proteins welches man untersuchen will mit der Sequenz eines Fluorophors wie z. B. GFP.
Wird nun das Protein von der Zelle gemacht, so hat es ein GFP an einem Ende mit dran hängen und über dessen Fluoreszenz kann man nun im Mikroskop den Weg und den Aufenthaltsort bestimmen.

Meine Aufnahmen zeigen nun einen Transporter (genauer eine Mutante davon aber das ist nicht so wichtig) für Monosaccharide und Polyole mit GFP funsioniert. DIe Fragestellung war:

Sitzt dieser Transporter in der Plasmamenbran oder in der Memran von der Vakuole? Also in der Haut vom großen Luftballon oder in der vom kleinen?

Wie ich vorhin gesagt habe, ist der Abstand zwischen den beiden Membranen ganz winzig. Jedoch:

Die Chloroplasten sitzen genau dazwischen. Befinden sich die Chloroplasten nun IN der grünen Kugel, so sitzt das Protein offensichtlich in der Plasmamembran, sitzen die Chloroplasten nun ausserhalb der grünen Kugel und hat die Kugel dazu noch Dellen und Einbuchteungen (vergleiche Luftballonmodell: Dort wo ein Smartie sitzt hat der kleine Luftballon eine Delle und weicht von der Kugelform ab), so befindet sich das Protein in der Vakuolmembran:

Hier mal ein Beispiel:

Der Transporter links sitzt in der Vakuole, der rechts in der Plasmamebran, kein Stack sondern nur 1 Aufnahme:



Hier nochmal das Bild von oben mit den Golgi Vesikeln

[Hyperion]

Hallo,

Ich würde ja gerne etwas sagen, aber dazu müsste ich die Bilder sehen. Ich sehe nur einen Eiswuerfel mit einem unglücklichen Frosch darin und den Titel "Domain Unregistered. To view, register at bit.ly/imageshack-domain"

Herzliche Grüsse
Eckhard

Hmm komisch. Sieht sonst jemand die Bilder nicht? Bei mir FF 3 und Win7 werden sie angezeigt, auch nach Cache Löschung...

[Detlef Kramer]

Hallo "Hyperion",

ich sehe alle Fotos und, als Cytologe im Ruhestand, kann ich sie auch interpretieren. Dein Vergleich der beiden Luftballons für Plamalemma und Tonoplast und Smarties dazwischen ist wirklich gut! Einen kapitalen Fehler hast Du Dir aber doch geleistet : der Zwischenraum zwischen Plasmalemma (=Plasmamembran) und Tonoplast ist das Cytoplasma. Das besteht aus dem Cytosol (=Grundplasma) und den darin eingebetteten Organellen, also von eigenen Membranen umgebenen Kompartimenten (ER, Dictyosomen, Microbodies). 

Herzliche Grüße

Detlef