Fluoreszenz im Auf- und Durchlicht

[peter-h]

Liebe Fluoreszenzler,

ein kleines Experiment zur Anregung.

Ein schöner Schnitt mit Wacker 3A Färbung im Hellfeld und nachfolgend in den 2 unterschiedlichen Blau-Anregungen.

Zunächst die wissenschaftlich richtige EPI-Anregung mit dem Zeiss EPI Kondensor IV FL , Filterblock 450-490 / FT 510 / LP 520 und einer blauen 3 Watt LED @ 455nm.



Umgeschaltet auf eine sehr einfache Durchlichtanregung. Weiße 3 Watt LED mit Schott Blaufilter BG12 4mm und als Sperrfilter ein Schott OG515 2mm ähnliches strenges Gelbglas.



Das Verhältnis der Anschaffungskosten könnte bei 100 : 1 liegen 
Anregungen sehr willkommen.

Fluoreszierende Grüße
Peter

[reblaus]

Hallo Peter -

Wen interessieren hier Billiglösungen? So ein Auflichtkondensor am Mikroskop wertet das doch bedeutend auf und macht sich viel besser, wenn man Laien mit seiner Ausrüstung beeindrucken will! Das sollte einem doch ein paar hundert € wert sein!

Ernst beiseite:

Da ich auch oft solche Präparate zum Testen benutze, würden mich die Erfahrungen der Forumsmitglieder betreffend Eigenfluoreszenz verschiedener Farbstoffe interessieren. Z.B.: Die Gelbfluoreszenz von verschiedenen Holzbestandteilen und Flavonoiden im Blaulicht ist bekannt - welchen Beitrag liefert nun die Wacker-Färbung?
Oder für die Zoo-Histologen: Wie stehts mit der Fluoreszenz der HE-Färbung bei der Nutzung von Bordmitteln?

Etc....

Viele Grüße

Rolf

[derda]

Hallo Peter,

schöne Aufnahmen. Göke führt in seinem Buch, "Moderne Methoden der Lichtmikroskopie", als Vorteil der Auflichtfluoreszenz folgendes auf:

"... Sie liefert nicht nur eine größere Fluoreszenzintensität als die Durchlichtanregung, sondern lässt sich auch am besten mit anderen Verfahren, zum Beispiel Durchlicht-Phasenkontrast und -Dunkelfeld, kombinieren. ..."

Ich selbst habe noch nie solche Kombinationskontrastbilder gesehen, vielleicht zeigt jemand welche?

VG, Erik

[Ole]

Hallo Erik,
es sind zugegeben nicht die schönsten Aufnahmen, aber als Beispiel vielleicht geeignet (hatte ich schon einmal gezeigt):


Goldalgen. Obere Reihe. Oben Links: DIK, Mitte: Hellfeld, rechts: Phako
Die drei unteren Abbildungen sind eine Kombination von Auflicht-Fluoreszenz (UV) und Phako (Licht stark gedimmt)
Ohne die Kombination wären nur die rosa/roten Bereiche erkennbar.

Viele Grüße,
Ole

[derda]

Hallo Ole,

vielen Dank für die schönen Bilder, sehen verdammt gut aus.

VG, Erik

[peter-h]

Tolle Bilder Ole,

und hier mein Beitrag zur Kombination von Auflichtfluoreszenz mit Phasenkontrast im Durchlicht. Der grüne Hintergrund kommt vom Grünfilter im Durchlicht.

Casuarina glauca , Olympus SPlan 40/0,65 PL


wie vorher , anderer Ausschnitt vom gleichen Präparat.


Übersicht mit Auflichtfluoreszenz und Durchlicht-Dunkelfeld mit Grünfilter.
Bunt wird es immer 

Es kommt also sehr auf das Präparat , die Färbung und noch viele weitere Punkte in der Technik an. Jedenfalls ist die Kombination von Auflicht-Fluo und Durchlicht, ob mit oder ohne Phasenkontrast eine sehr interessante Betrachtung.

Grüße
Peter

[Rawfoto]

Hallo Peter

Danke fuer das Zeigen der Kombination mit Dunkelfeld, sieht man sehr selten ...

:-)

Gerhard

[-JS-]

Hallo und guten Tag,
@rolf:

welchen Beitrag liefert nun die Wacker-Färbung?

Nachstehend ein kleines Beispiel zur Umsetzung der Wacker 3A Färbung mit Auflicht-
Fluoreszenz (Anregung 470nm, Dichroit 580nm, Sperrfilter 585nm).
Objekt: Ammophila arenaria (Schnitt, Präparation und Wacker-Färbung von Jörg Weiss
aka Fahrenheit).
Aufnahme mit Zeiss Standard WL, PlanApo 10x, S-KPL 10x/20BR, Zwischenoptik
Zeiss 47 60 29 / f=63mm, Kamera Canon EOS 5D MKII.



Die Aufnahme ist (ausser der für die Einstellung notwendigen Verkleinerung) ohne weitere
Veränderungen.
Viele AF-Fluo-Grüße
Joachim

[reblaus]

Hallo Joachim -

sehr schön - aaaaber:

jetzt hätte ich gerne noch die ungefärbte Kontrolle im gleichen Licht!

Viele Grüße

Rolf

P.S. Korrektur: Ich meinte natürlich eine ungefärbte Kontrolle ....

[Bernd]

Hallo Peter (und alle anderen, die Bilder in diesem Thread eingestellt haben),

die Bilder gefallen mir gut bis sehr gut! Aber eine ernstgemeinte Frage: du schreibst

Zunächst die wissenschaftlich richtige EPI-Anregung mit dem Zeiss EPI Kondensor IV FL , Filterblock 450-490 / FT 510 / LP 520 und einer blauen 3 Watt LED @ 455nm

und zeigst dann die Aufnahmen deiner nach Wacker gefärbten Schnitt. Das ist doch kein wirklicher Vergleich. Das Filterset ist doch speziell dafür gemacht, Green Fluorescent Protein (GFP) zu analysieren, bei dem Anregungsmaximum bei ca. 482 nm und Emission bei etwa 510 nm relativ dicht beieinanderliegen (um bei pflanzlichen Zellen auch noch die Chlorophyll-Autofluoreszenz zu unterdrücken, gibt es auch noch wesentlich teurere Schmalbandfilter). Glaubst du, das deinen Filterkombination auch bei GFP funktioniert? Das kann ich mir nicht so recht vorstellen. Oder ist es so ahnlich - du bist ja auch Hobbyastronom - als wolltest du versuchen, auf der Sonne Protuberanzen mit einem H-alpha-Filter für die Deep-Sky Fotografie zu beobachten, welches ja nur ein Bruchteil von einem "richtigen" H-alpha Filter kostet, aber für die Beobachtung von Protuberanzen eben auch nicht funktioniert?

Viele Grüße
Bernd

[Ole]

Hallo,
Rolf hatte weiter oben um eine Aufnahme eines HE-Präparates gebeten. Anbei ein Präparat des Regenwurms (Präparat von G. Rosenfeldt), HE-gefärbt, einmal im Hellfeld und einmal in der Fluoreszenz. Interessanterweise zeigen die Fluoreszenzaufnahmen einige Details (grünlich dargestellt), die bei der HE-Färbung nicht dargestellt werden. Es könnte sich hierbei um Schleim o.ä. handeln.




Noch eine Anmerkung zur Überlagerung verschiedener Beleuchtungsverfahren. In meinem obigen Beitrag hatte ich Phako und Auflicht-Fluoreszenz kombiniert. Da es sich um eine UV-Anregung handelte, blieben die "normalen" Farben des Phako-Bildes erhalten. Hätte ich dagegen (bei einem fiktiven anderen Präparat) z.B. eine Grünlicht-Anregung mit rotem Emissionsfilter gewählt, wären Fluoreszenzsignale und Phako-Bild beide rot. Bei dem Beispiel unten (die Einzelbilder hatte ich schon früher einmal gezeigt) habe ich eine Dunkelfeldaufnahme und ein Fluoreszenzbild "in silico" überlagert. Bei dem Präparat handelt es sich um ein normales Frischpräparat aus dem Gartenteich. Alle Aufnahmen zeigen den gleichen Ausschnitt!

1) Zunächst das Dunkelfeld:


2) Eine AFL-Aufnahme bei Blauanregung (BP 450 – 490nm, DM 510nm, LP 515nm). Hier wird das Chlorophyll der Algen angeregt und leuchtet rot.


3) Eine AFL-Aufnahme bei Grünanregung (BP 515 – 560nm, 580nm, LP 590nm). Hier fluoreszieren offenbar Cyanobakterien, das Chlorophyll der Algen wird hingegen kaum angeregt.


Würde man parallel das Dunkelfeldbild mit dem AFL-Bild (Grünanregung) im Mikroskop überlagern, erhielte man ein rötliches Dunkelfeldbild, da sich das Sperrfilter im Strahlengang befindet. Stattdessen kann man aber die beiden Bilder separat aufnehmen und anschließend im PC überlagern. Im einfachsten Fall reicht es, die Bilder als Ebenen übereinanderzulegen und die oberste Ebene teilweise transparent darzustellen. Das sieht dann wie folgt aus:


Und diese Form der Überlagerung klappt auch mit Durchlicht-Fluoreszenzbildern, dafür bedarf es keiner AFL-Einrichtung. Allerdings sollte man auch darauf achten, dass auch die Maßstabsbalken an den gleichen Positionen in den Bildern sind  . Da sich die Transparenz des obersten Bildes einstellen läßt, kann der Hintergrund mehr oder weniger "eingeblendet" werden.
Vielleicht haben die Fotoprofis ja auch noch bessere Tipps für uns, wie man solche Bilder überlagern kann, ich vermute, da gibt es noch deutlich effektivere Ansätze. Meine "Fotokünste" reichen leider bislang nur zur Überlagerung der Ebenen.

Viele Grüße,
Ole

[-JS-]

Hallo und guten Tag,

aufgrund der Bitte von Rolf Blaich
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=9083.msg64489#msg64489
habe ich zum Einen ungefärbte Schnitte von Ammophila arenaria sowohl im Durchlicht als auch mit Auflicht-Fluoreszenz dargestellt.
Das hierzu verwendete in AFE fixierte Ausgangsmaterial wurde freundlicherweise von Jörg Weiß zur Verfügung gestellt.
An dieser Stelle noch einmal ein herzliches Dankeschön an Jörg für seine schnelle Hilfe.

Zusätzlich wurden mit den drei Farbelementen der Wacker-Färbung einzeln gefärbte Schnitte sowohl im Durchlicht als auch mittels Auflicht-Fluoreszenz abgebildet und abschließend unter den gleichen Bedingungen nochmals der bereits gezeigte mit W3A gefärbte Blattquerschnitt des Strandhafers.

Die Schnitte wurden mit Leica-Klinge und 'Möhrentechnik' hergestellt [ wobei sich übrigens sehr schnell herausstellte, daß ich noch viel zu lernen habe :-) ].
Die ungefärbten sowie die einzeln mit Acridinrot, Acriflavin und Astrablau gefärbten Schnitte wurden nach Wasserentzug (2-Propanol) in Euparal eingeschlossen.

Technik:
Zeiss WL, PlanApo 10x und 25x, S-KPL10x, Zwischenoptik 476029, EOS5D.
AL-Fluoreszenz: Anregung 470/40, Dichroit 580nm, Sperrfilter 585nm
Beleuchtung (DL und AL-Fluo) Cree XM-L T6 bei 1A
Belichtungszeiten (200 ASA): AL-Fluo zwischen 0,5 und 15 sec, DL 1/125 bis 1/800

Anmerkungen zu den Ergebnissen:
Ungefärbte Schnitte:
Im Gegensatz zu den relativ ausdrucklosen DL-Darstellungen der ungefärbten Schnitte zeigt die
Auflicht-Fluoreszenz zwar schwach ausgeprägte (10 sec Belichtungszeit, life-view ließ leider nur 'grünliche Schatten im Schacht' erahnen), aber sehr wohl vorhandene Farbdifferenzierungen. Es ist neben der äußeren, orangerot leuchtenden Cuticula auch eine innere zu erkennen, die sich im Bereich der bulliformen Zellen teilweise rötlich darstellt. Sklerenchym, Leitbündelscheiden, Xylem und Phloem sind nicht weiter differenziert, alle genannten Gewebe fluoreszieren mehr oder weniger stark grün. Das Assimilationsparenchym zeigt keine Fluoreszenz.

Schnitte nach Färbung mit Acridinrot
Im DL sind erwartungsgemäß alle Zellen violett eingefärbt, lediglich die noch mit Luft gefüllten Haare erscheinen aufgrund der Lichtbrechung dunkelgrau bis schwarz.
Bei AL-Fluo tritt das Phloem der geschlossenen LB farblich deutlich hell abgesetzt hervor, alle anderen Zellen fuoreszieren rot, das Assimilationsparenchym wenig bis gar nicht.

Schnitte nach Färbung mit Acriflavin
Im DL fallen ebenfalls die noch mit Luft gefüllten Haare auf, das Xylem und das Phloem sind farblich abgesetzt, ebenso das Assimilationsparenchym. Die restlichen Gewebe erscheinen einheitlich gelb.
Die Al-Fluo setzt mit grün fluoreszierenden Haaren, rot-bräunlich erscheinenden bullösen Zellen,
ockerfarbigem Phloem und einem differenziert erscheinenden Assimilationsparenchym ein paar interessante Akzente.

Schnitte nach Färbung mit Astrablau
Im DL zeigen sich Phloem und bullöse Zellen mit dunkelblauer Farbe deutlich abgesetzt. Das Assimilationsparenchym fällt durch dunkle Färbung auf, die restlichen Gewebe sind durchgehend türkisfarben.
Die AL-Fluo ist sehr schwach (15 sec Belichtungszeit, tiefschwarzer Screen bei life-view). Die äußere Cuticula fluoresziert rötlich (die innere ist hier nicht abgesetzt bzw. erkennbar), das Assimilationsparenchym und Xylem fluoreszieren schwach, die restlichen Gewebe einheitlich leuchtend grün, das Phloem, die Haare und die bulliformen Zellen gar nicht.

Schnitt nach Färbung mit W3A (Präparat von Jörg Weiß)
Zu Beschreibung der DL-Darstellung wird auf den Artikel von Jörg verwiesen:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=6518.msg44637#msg44637
Die AL-Fluo zeigt das Assimilationsparenchym nicht fluoreszierend in grüner Farbe, Sklerenchym in Gelb, Leitbündelscheide in leuchtendem Hellgrün. Das Phloem ist dunkelgrün und fluoresziert nicht, ebenso wie die bulliformen Zellen. Bedingt durch diesen Umstand treten aber die Stomata als leuchtend gelbe Punkte sehr schön erkennbar hervor.

Fazit:
Die drei 'Wacker-Farben', für sich getrennt eigesetzt, zeigen in der AL-Fluo interessante Modifikationen des Themas 'Blattquerschnitt eines borealen Grases'.
(Mein Favorit ist übrigens die AL-Fluo-Darstellung des Schnittes nach alleiniger Acriflavin-Färbung).
Und: Es lohnt sich durchaus, auch einmal das ungefärbte Präparat mit Auflicht-Fluoreszenz anzuschauen. Vielleicht dies auch nur, um die Frage 'Fluoresziert das Zellmaterial oder bloß der Farbstoff?' eindeutig beantworten zu können.

Ich wünsche viel Spaß beim Betrachten der Bilder.
Gruß
Joachim

Ammophila arenaria, ungefärbt / Wasser (DL, PlanApo10x)

wie oben, AL-Fluo, PlanApo10x


Ammophila arenaria ungefärbt / Wasser (DL, PlanApo 25x)

wie oben, AL-Fluo, PlanApo25x


Ammophila arenaria gefärbt mit Acridinrot, Euparal. DL, PlanApo 10x

wie oben, AL-Fluo, PlanApo 10x


Ammophila arenaria gefärbt mit Acriflavin, Euparal. DL, PlanApo 10x

wie oben, AF-Fluo, PlanApo 10x


Ammophila arenaria gefärbt mit Astrablau, Euparal. DL, PlanApo 10x

wie oben, AF-Fluo, PlanApo 10x


Ammophila arenaria, Präparat von Jörg Weiß, Färbung W3A; DL PlanApo 10x

wie oben, AL-Fluo 10x

[Rawfoto]

An alle Beteiligten,

Spitze, einfach spitze und tolle Beschreibung ...

Danke & und Gruesse aus den Fotocamp in Bulgarien :-))

Gerhard

[reblaus]

Hallo Joachim -

vielen Dank für die Mühe, die du hier auf dich genommen hast. Jetzt beginnt nämlich die Sache jenseits  schöner Farben mit und ohne Fluoreszenz wissenschaftlich interessant zu werden!

Mich z.B. würde besonders interessieren, woher die rote Fluoreszenz der Cuticula in der ungefärbten Kontrolle kommt. Bei meinen bisherigen oberflächlichen Fluoreszenz-Blicken auf verschiedene Schnitte von anderem Frischmaterial ist mir das nämlich noch nirgends aufgefallen.

Die Cuticula hat ja einen schwammförmigen Aufbau aus Cutin, dieser Schwamm wird durch die Zellwand hindurch mit Wachs getränkt, das bei starker Produktion auf der Oberseite des "Schwamms" wieder austritt und den bekannten bläulichen Wachsbelag bildet. Natürlich sind noch weitere Substanzen im Spiel, und bei Arenaria könnte man davon ausgehen, dass die Cuticula besonders dicht konstruiert ist.

Die Fülle der übrigen Färbungen und Vergleiche wird noch einige Zeit in Anspruch nehmen, aber bei weiterer Beobachtung werden sicher noch einige interessente Hinweise auftreten.

Nochmals Glückwunsch!

Rolf

[Frank D.]

..... Jetzt beginnt nämlich die Sache jenseits  schöner Farben mit und ohne Fluoreszenz wissenschaftlich interessant zu werden! ....

Hallo Rolf,

in diesem Beitrag hatte ich die zusätzliche Detailerkennung durch Fluoreszenz angesprochen.
Vergleiche die Flimmerhärchen von Bild 1 (Durchlicht/schräge Beleuchtung) mit denen von Bild 3 (Auflicht-Fl).

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=5126.msg34683#msg34683

MfG
Frank