Fluoreszens

Pommbaer · Mai 29, 2011, 19:36:17 NACHMITTAGS

Mal eine Frage zur Fluoreszens:

Brauche ich dafür wirklich nur eine Lichtquelle die über ein ausreichendes Spektrum an Wellenlängen verfügt und Sperrfilter verschiedener Wellenlängen um "Farbtöne" auszusperren?

Oder braucht's dafür noch mehr Ausrüstung ?

Grüße

Philipp

Eckhard F. H. · Mai 29, 2011, 20:08:21 NACHMITTAGS

Eine gute Frage! Ich schließe mich an.

Gruß - EFH

David 15 · Mai 29, 2011, 20:11:41 NACHMITTAGS

Ja würde mich auch mal interessieren

Viele Grüße
David

Frank D. · Mai 29, 2011, 20:54:48 NACHMITTAGS

Zitat von: Pommbaer in Mai 29, 2011, 19:36:17 NACHMITTAGS
Mal eine Frage zur Fluoreszens:

Brauche ich dafür wirklich nur eine Lichtquelle die über ein ausreichendes Spektrum an Wellenlängen verfügt und Sperrfilter verschiedener Wellenlängen um "Farbtöne" auszusperren?

Oder braucht's dafür noch mehr Ausrüstung ?

Grüße

Philipp

Hallo Philipp,

oberflächlich kann man Deine Frage mit JA beantworten.
Du brauchst natürlich fluoreszierende Präparate, wie z.B. das Chlorophyll im Blattwerk, das Fluorit als Mineral oder fluoreszierende Farbstoffe.
Die von Dir genannten Sperrfilter sperren einerseits alle Wellenlängen bis auf den Erregerwellenlängenbereich im Beleuchtungsstrahlengang (Erregerfilter),
und im beobachtenden Strahlengang sollte ein Filter sitzen, das dieses Erregerlicht nicht durchlässt (Sperrfilter).

Der Aufbau kann also relativ einfach sein.

Herzliche Grüße
Frank

hinrich husemann · Mai 29, 2011, 20:56:30 NACHMITTAGS

Hallo Fluoreszenz-Fragende,
nur ganz allgemein und prinzipiell: Die Anregungsstrahlung bei Fluoreszenz ist generell kurzwelliger (also mehr in Richtung blau, violett, UV); die im Objekt dadurch angeregte Fluoreszenzstrahlung langwelliger (also mehr in Richtung gelb, rot). Ihre Lichtquelle sollte es also ausreichend im Kürzerwelligen können (i.A. mindestens Halogenleuchte). Ihr Anregungsfilter soll also davon nur den jeweils benötigten kurzwelligen Bereich durchlassen; im einfachsten Falle also ein entsprechender Blaufilter. Der Filter zur Beobachtung darf vom Anregungsbereich nichts durchlassen; im einfachsten Falle also ein "solider" Gelbfilter. Bei Nichtfluoreszenz darf durch die Kombination Beider nichts durchkommen. Technisch am einfachsten und am Wenigsten aufwendig ist die Durchlicht-Fluoreszenz. Mit einem wirksamen Blaufilter zur Beleuchtung unter dem Kondensor (diesen weit öffnen!) und einem wirksamen Gelbfilter oberhalb des Objektivs kann man schon eine ganze Menge machen! Voraussetzung sind natürlich fluoreszenzfähige Objekte!
Freundliche Mikrogrüsse
H. Husemann

-JS- · Mai 29, 2011, 23:37:42 NACHMITTAGS

Hallo,
neben der von Hinrich bereits erläuterten Durchlicht-Fluoreszenz gibt es die ein ganz klein bisschen [

] aufwändiger konstruierte Auflicht-Fluoreszenz (AL-Fluo).
Auch diese Version benötigt eine Beleuchtungsquelle im kurzwelligen Bereich des Lichtspektrums, gebräuchlich sind hier neben Quecksilberhochdrucklampen heute auch vielfach LED's oder andere geeignete Lichtquellen mit Wellenlängenbereichen um 400-450 nm und auch (z.T.) wesentlich niedriger.
Der Anregungsfilter ist bei der AL-Fluo oft sehr aufwändig aus mehreren Schichten konstruiert, die den Durchlass von sehr engen Wellenlängen-Bandbreiten im Bereich der anzuregenden Farbstoffe oder Gewebetypen zulassen können.
Im Gegensatz zur Durchlicht-Fuoreszenz wird bei der AL-Fluo aber kein Kondensor benötigt. Das mikroskopische Objektiv ist hier gleichzeitig Kondensor, es werden die physikalische Prinzipien der gegenseitigen Durchdringbarkeit von Lichtstrahlen ausgenutzt. Damit wird aber der gleichzeitig der Vorteil erzielt, die gleiche numerische Apertur sowohl für die Beleuchtung als auch für die Beobachtung zur Verfügung zu haben.
Wesentlicher Bestandteil der AL-Fluo ist jedoch der Umlenkspiegel, der oberhalb des Objektives im Beleuchtungsstrahlengang in einem Winkel von zumeist 45° montiert ist. Dieser Spiegel hat mehrere Aufgaben. Er ist für die abgestrahlte Wellenlänge der durch entsprechende Anregung erzeugte fluoreszierenden Farbe zumindest zu 95% auf dem Weg zum Okular durchlässig, allerdings lässt er kaum Licht der Anregungswellenlänge in Richtung Okular passieren, sondern reflektiert diese nahezu vollständig zur Lichtquelle zurück. Diese sog. dichroitischen Spiegel sind relativ aufwändig konstruierte sehr dünne (0,8 - 1,2 mm) und tlw. mehrfach bedampfte bzw. hochwertig verspiegelte Glaskonstruktionen.
Den Abschluss im optischen Strahlengang der AL-Fluo bildet, ähnlich wie bei der Durchlicht-Fluo auch, der Sperrfilter. Letzterer eliminiert möglicherweise noch vorhandene Restlichtmengen aus der Anregungsseite und lässt im Idealfall nur den engen Wellenlängen-Bereich der abgestrahlten Fluoreszenz des untersuchten Objektes zum Betrachter durch.
Es verbleibt noch anzumerken, dass AL-Fluo aufgrund des hohen Aufwandes im optischen resp. mikroskopisch-mechanischen Bereich nicht sooo ganz billig ist

Viele Grüße
Joachim

Pommbaer · Mai 29, 2011, 23:45:23 NACHMITTAGS

Die Erklärungen sind sehr ausführlich, allerdings stellen sich mir als Laie damit neue Fragen:

Kann ich das an meinem Standard 14 also mittels Lichtquelle ( UV-Lichtquellen in Form von Kathode oder LED vorhanden ) doch simple Fluoreszierende Objekte erstmal so im Durchlicht betrachten?
Sofern diese Farbstoffe besitzen die dadurch angeregt werden also auch ohne irgendwelche Sperrfilter?

Und benötige ich - soweit ich das richtig verstehe - die Sperr- oder Erregerfilter nur um halt spezielle Farben sichtbar zu machen und sehe ohne diese Filter nur einen "Farbmischmasch" der Fluoreszens?

Und die Frage, wo ich einen Filter im Beobachterstrahlengang unterbringen kann.
Für den Beleuchtungsstrahlengang gibt es ja beim Zeiss extra Filterhalter, wo ich gerade eh dabei bin einen günstig zu ergattern da ich nur einen Kondensor mit Blende habe.
Im Beobachterstrahlengang sehe ich häufig Mikroskope mit einem Schieber zwischen Stativ und Tubus. Ich habe da allerdings "nichts" zwischen und wüsste nicht wo so ein Filter hin sollte. Einfach den Tubus abnehmen und dazwischenlegen? Oder gibt es hier auch eine günstige praktikablere Variante?

Und eine Frage fällt mir gerade ein, die früher oder später sowieso kommt:
Wo kann man günstig an Sperrfilter kommen ? Die Filterset's von den bekannten Mikroskopherstellern sind i.d.R. doch recht teuer für einen Studenten.

Grüße

Philipp

Nomarski · Mai 30, 2011, 00:07:37 VORMITTAG

ZitatUnd benötige ich - soweit ich das richtig verstehe - die Sperr- oder Erregerfilter nur um halt spezielle Farben sichtbar zu machen und sehe ohne diese Filter nur einen "Farbmischmasch" der Fluoreszens?

Das Erregerlicht kann sich sowohl im sichtbaren Bereich als auch im UV-Bereich befinden. Das heißt, man kann mit ultravioletten, violetten, blauem oder sogar noch grünen Licht anregen.
Das violette, oder blaue Licht würdest du auf jeden Fall noch sehen, wenn auch nur als Hintergrund.
So wird hinter dem Objektiv ein Sperrfilter angeordnet, der das Erregerlicht nicht mehr direkt passieren läßt, der Hintergrund ist also zunächst schwarz. Nur Materialien, die vom Erregerlicht angestrahlt werden und dabei ein Licht der längeren Wellenlänge aussenden, sind dabei zu sehen.
Der Erregerfilter muß natürlich so beschaffen sein, daß er die Lichtstrahlen, welche bei der Fluoreszenz entstehen, auch noch passieren lassen kann. Es werden im einfachen Fall Langpassfilter genommen, die das Licht ab einer bestimmten Wellenlänge durchlassen, in manchen Fällen auch Bandpässe. Die Filtersätze werden nach den zu untersuchenden Materialien ausgewählt, es gibt daher viele Kombinationen. Aber eins bleibt immer gleich:
Die Wellenlänge vom Anregungslicht ist immer kürzer als die vom Licht, welches den Sperrfilter passieren kann.

reblaus · Mai 30, 2011, 01:45:53 VORMITTAG

Hallo -
vielleicht noch eine Vereinfachung für den Anfang:

Für Botaniker bietet die Anregung mit blauem Licht das beste "Preis-Leistungsverhältnis". Man bekommt dann z.B. gelbe Fluoreszenz von Flavonoiden und Ligninbestandteilen oder rote Fluoreszenz, z.B. vom Chlorophyll oder von den Farbstoffen die man zur Anfärbung seines Stengelquerschnittes benutzt hat.

Wenn man zur Anregung bei Durchlicht eine blaue LED benutzt, braucht man kein Anregerfilter unter dem Präparat, das nur blau durchlässt - weil diese Diode ohnehin nur blaues Licht produziert und davon entsprechend viel. Ein Gelbfilter über dem Objektiv, das das blaue Anregerlichtlicht blockiert und nur das gelbe bis rote Fluoreszenzlicht durchlässt ist relativ billig zu kriegen.

Wenn man eine Halogenlampe oder eine weiße LED benutzt und nur das blaue Licht herausfiltert ist das eine relativ ineffizienten Angelegenheit und liefert deshalb bei Normalausrüstung mit 10-20 W Halogen bzw. 3 W LED eine relativ schwache Beleuchtung.

Was billiger ist, hängt davon ab wie man gerade ausgerüstet ist und ob man ggf. eine blaue LED billiger kriegt als ein Blaufilter.

Viele Grüße

Rolf

Dr. Jekyll · Juni 01, 2011, 15:43:27 NACHMITTAGS

Hallo,

Zitat von: reblaus in Mai 30, 2011, 01:45:53 VORMITTAG
Wenn man eine Halogenlampe oder eine weiße LED benutzt und nur das blaue Licht herausfiltert ist das eine relativ ineffizienten Angelegenheit und liefert deshalb bei Normalausrüstung mit 10-20 W Halogen bzw. 3 W LED eine relativ schwache Beleuchtung.

Das kann ich nicht bestätigen!
Ich arbeite am Orthoplan mit Ploemopak und einem Filterblock H (violett/blau) und einer Cree XR-E 7090 R2 und habe bei Verwendung von 6,3X Okularen und Neofluar-Objektiven eine hervorragende Lichtausbeute.
Bei Verwendung eines I2-Filterblocks ist die Ausbeute etwas schwächer aber immernoch sehr gut.
Als Vergleich habe ich eine Seoul P4 (blau) genommen. Das Ergebnis erscheint mir nahezu identisch (subjektiver Eindruck).

Gruß
Harald

P.S.: Was ist mit "Normalausrüstung" gemeint? Bei Fluoreszenzmikroskopie sind Fluoreszenz- oder Fluorit-Objektive denke ich "normal".

reblaus · Juni 01, 2011, 18:13:35 NACHMITTAGS

Hallo Harald -

also ich gebe hiermit zu dass die statistische Basis für meine Aussage zu gering ist, zumal sich meine Kenntnisse
auf Zeiss (alt) Auflichtkondensor IV FL bzw. III RS beschränken. Allerdings habe ich ebenfalls Seoul P4 (blau) mit diversen weißen 3W-Crees verglichen unter Verwendung eines Erregerfilters 450-490.

Zu "Normalausrüstung" wäre anzumerken , dass die Fluoreszenz-Eignung mancher Zeiss Plan-Apochromaten (z.B. 40/0,9) besser ist als die analoger Neofluare.

Gruß

Rolf

Dr. Jekyll · Juni 01, 2011, 18:21:55 NACHMITTAGS

Hallo Rolf,

danke für den Tipp mit den Plan-Achromaten, werde meine Objektive daraufhin einmal durchforsten.

Gruß
Harald

Pommbaer · Juni 01, 2011, 19:12:39 NACHMITTAGS

Entnehme ich das den vorangegangenen Postings, dass eine Fluoreszensbetrachtung mit normalen Achromaten garnicht möglich ist?

Normalausrüstung heisst bei mir:
Standard 14 mit LED-Umbau und drei normalen Achromaten. Eines von CZJ und dann zwei Zeiss West.

Werner Jülich · Juni 01, 2011, 19:20:41 NACHMITTAGS

Selbstverständlich ist eine Fluoreszenzanregung auch mit normalen Achromaten sichtbar. Dazu schaun Sie sich einmal die Transmissionskurven der Plan-A(chromate) auf der Zeiss-Seite an. Achromate schneiden ähnlich ab.
Erst wenn die Anregungswellenlänge extrem kurzwellig wird, kommen Objektive aus normalen Gläsern an ihre Grenzen. Dazu betrachten Sie einmal die Transmissionskurven der EC Plan-Neofluare.
Werner Jülich

Dr. Jekyll · Juni 02, 2011, 10:47:36 VORMITTAG

Habe jetzt einige Achromate und Plan-Achromate mit dem Filterwürfel H und I2 (bei Verwendung der weißen LED Cree XR-E 7090 R2) getestet. Auch mit diesen Objektiven erhalte ich ein sehr helles Bild am Orthoplan mit Ploemopak. Bei Verwendung der selben LED und der selben Objektive habe ich am Zeiss-Universal mit III RS-Revolver (Zeiss-Filzersatz 10 = Leitz-Fiterwürfel I2) ein etwas lichtschwächeres Bild.
Beim Vergleich von Zeiss-(Plan-)Achromaten mit Leitz-(Plan)-Achromaten lieferten die Leitz-Objektive ein deutlich helleres Bild. Sowohl beim Vergleich von 10x-Objektiven als auch bei den 40x-Objektiven.
Vielleicht hat noch jemand Lust einige Zeiss-Achromate mit Leitz-Achromaten zu vergleichen. Wüsste gern ob die Lichtausbeute der Leitz-Objektive bei Fluoreszenz im Blau/Violett-Bereich generell besser ist.

Gruß
Harald