Autor Thema: Wacker für alle – eine Simultanfärbung mit einem Farbgemisch aus Acridinrot ...  (Gelesen 24961 mal)

Rolf-Dieter Müller

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Liebe Mikrogemeinde,

die beliebte Wackerfärbung scheint bisher nur von einem kleineren Kreis ambitionierter Mikroskopiker angenommen zu sein. Gut, als Dreifachfärbung vielleicht nicht ganz einfach umzusetzen, zumal sie nur bei genauer Beachtung der Färbevorschrift im Ergebnis zufriedenstellend ausfällt.

Es geht aber noch einfacher, wenn man auf die kleinen virtuosen Tipps und Tricks zur Vervollkommnung verzichtet und sich nur auf ein Farbgemisch beschränkt, wie wir es von der Etzoldfärbung her kennen.

Den nachstehenden Greiskraut-Querschnitt habe ich aus einer frisch gesammelten Pflanze mit dem Haga Mikrotom (Rasierklingenmikrotom) geschnitten. Die Schnitte wurden danach für 1 Stunde in 70% Ethanol fixiert und dann zwei Schnittserien mit dem folgenden Farbgemischen gefärbt:

Wacker simultan I = ausgehend von den Stammlösungen (1) 3 Teile Astrablaulösung + 2 Teile Acriflavinlösung + 2 Teile Acridinrotlösung, für die Färbung mit 10 Teile Wasser verdünnen.

Wacker simultan II = 6 Teile 0,1%ige Alcianblaulösung + 2 Teile Acriflavinlösung + 2 Teile Acridinrotlösung, für die Färbung mit 5 Teile Wasser verdünnen. Acriflavin- und Acridinrotlösung aus Stammlösungen (1).

Der Färbeablauf erfolgte streng nach der ausführlichen Beschreibung der Etzoldfärbung in der Mikrofibel (2) und somit der Einschluss in Euparal.

Bitte beachten, das die folgenden Ergebnisse nur bei Verfahren erreicht werden, bei denen die Entwässerung ohne Alkoholstufen in konz. Isopropylalkohol erfolgt. Der Grund ist ganz einfach, denn hierin wird die Färbung, besonders die Farbbestandteile Acridinrot und Acriflavin schonend differenziert.

Die Zusammensetzung der beiden Farbgemische erfolgte intuitiv, Verbesserungen sind in jedem Fall möglich. Zum Beispiel Astrablau feinfühliger einstellen bzw. Acridinrot nur auf das notwendige Maß reduzieren. Mit Acriflavin als Bestandteil vorsichtig umgehen, eine Erhöhung der Konzentration kann das Gesamtbild negativ beeinflussen.

Zu den Aufnahmen: Alles Einzelbilder (je Abbildung aus ca. 6 bis 9 Einzelaufnahmen) mit Photomerge zum Übersichtsbild (Zeiss Plan-Neofluar 10x) und Ausschnittsbild (Zeiss Plan-Neofluar 40x) zusammengesetzt. Kamera Nikon D5000. Maßstabsbalken und Text mittels Zeiss AxioVision light eingefügt.









Ein Hinweis noch: Die ganze Schönheit der Wackerfärbung lässt sich erst so richtig mit Halogenbeleuchtung genießen, wobei Dunkelfeld dann ein ganz besonderes Erlebnis ist.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller


(1) Wacker, Robin: Eine neue und einfache Methode zur polychromatischen Anfärbung von Paraffinschnitten pflanzlicher Gewebe für Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie. Mikrokosmos Heft 4/2006, Seite 210-212.
(2) Henkel, Klaus: Die Mikrofibel. Ausgabe 14. Juni 2003. Seite 183-188.

Eckhard

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Lieber Rolf-Dieter,

mit diesem Verfahren hast Du die W3A Färbung endgültig narrensicher gemacht  ;) Ich bin erstaunt, wie gut das Färbeergebnis geworden ist.

Herzliche Grüsse aus Berlin
Eckhard
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Rolf-Dieter Müller

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Lieber Eckhard,

vielen Dank für Deine Einschätzung. Ja Du hast recht, diese Simultanfärbung scheint mir auch sehr robust.

Bei unserem Juni-Workshop des Mikroskopischen Kollegiums Bonn werde ich diese Färbung vorstellen, da wird sich die Eignung in der Praxis zeigen.

Im Ergebnis muss man die Färbung so nehmen wie sie ausfällt. Es ist dann natürlich keine Anpassung möglich. Das geht nur mit Einzelfärbungen, wie sie ja gerade Du immer wieder meisterhaft mit Deinen Schnitten zeigst.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

Mila

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Lieber Rolf-Dieter,

auf den Workshop freue ich mich sehr und fände es fantastisch, wenn die Simultanfärbung im Unterricht mit bis zu 32 Schülern gleichzeitig und komplikationslos durchführbar wäre.
Dein Ergebnis ist beeindruckend!

Herzliche Grüße
Mila

Fahrenheit

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Lieber Rolf-Dieter,

danke für die spannende Weiterentwicklung der Wacker-Färbung! Ich freue mich schon auf unseren Workshop im Juni und werde bis dahin getestet haben, wie sich Deine Rezepte bei der Verwendung an aufgezogenen Paraffinschnitten verhalten.

Herzliche Grüße
Jörg
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Detlef Kramer

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Re: Wacker für alle – eine Simultanfärbung mit einem Farbgemisch aus Acridinrot ...
« Antwort #5 am: Juni 02, 2011, 15:24:28 Nachmittag »
Lieber Rolf-Dieter,

wirklich beeindruckend schöne Ergebnisse. Das werde ich schnellstmöglich für mich ausprobieren.

Herzliche Grüße

Detlef
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Fahrenheit

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Lieber Rolf-Dieter, liebe Pflanzenschnibbler,

hier nun die Ergebnisse der beiden Wacker Simultanfärbungen mit Astrablau (W3Asim I) und Aclianblau (W3Asim II) im Vergleich mit einer normalen Dreifachfärbung nach Wacker.

Gefärbt wurden auf den Objektträger aufgezogene Paraffinschnitte der Blüte von Hoya Carnosa (Wachsblume) mit einer Schnittdicke von 10 µm. Die Schnitte stammen von Marion Schemann und ich hatte sie mit einer Etzold FCA und einer abgewandelten Wacker Färbung (mit etwas Acriflavin im Astrablau beim letzten der drei Färbegänge) bereist im Thread zur Wachsblume gezeigt.

Entgegen der ursprünglichen Anleitung habe ich die Farblösungen nicht mehr mit Wasser verdünnt, sondern konzentriert auf die Schnitte gegeben. Die jeweiligen Färbeabläufe und Konzentrationen sind vor der zugehörigen Bildserie aufgeführt. Die Übersichtsaufnahmen sind nicht schön, sollen aber auf einfache Weise einen Gesamteindruck der Färbung bieten. Sie sind an einem Zeiss Standard 16 mit einem 2,5x Planobjektiv entstanden. Alle anderen Aufnahmen an Leica DME mit 20x PlanApo.

Färbung von drei Objektträgern in einem praktischen Döschen von Klaus - der Kunststoff ist sogar Xylol-beständig.


1. Wacker W3A

- Paraffinschnitt auf einem Objektträger aufgezogen
- Ausspülen des Paraffins mit Xylol (3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Überführen in Isopropanol (3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Ethanolreihe 100%, 70%, 50% (je 3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Färbung mit Acridinrot (1% in Ethanol 50%, 7 Minuten)
- Spülen mit Aqua dest.
- Färben mit Acriflavin (1% in Aqua dest,, 40 Sekunden)
- Spülen mit Aqua dest.
- Färben mit Astrablau (1% in Aqua dest., 80 Sekunden)
- Spülen mit Aqua dest.
- Entwässern mit Isopropanol rein (Abspülen des schräg gestellten OT mit ca. 2 ml, ein mal 1 Minute Einwirkzeit, 2 mal Wechseln mit je 3 Minuten Einwirkzeit)
- Eindecken in Euparal

Bild 1.1: Übersicht W3A Färbung, Vergrößerung 25x, Einzelaufnahme


Bild 1.2: Gewebe und Leitbündel, Vergrößerung 200x, Stapel aus 5 Bildern


Bild 1.3: Pollinium und umliegendes Gewebe, Vergrößerung 200x, Stapel aus 6 Bildern


2. W3Asim I (Astrablau)

- Paraffinschnitt auf einem Objektträger aufgezogen
- Ausspülen des Paraffins mit Xylol (3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Überführen in Isopropanol (3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Ethanolreihe 100%, 70%, 50%, 30% (je 3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Spülen mit Aqua dest.
- Färben mit W3Asim I unverdünnt (Astrablau 1%, Acriflavin 1% und Acridinrot 1% (in Ethanol 50%) im Verhältnis 3:2:2)
- Spülen mit Aqua dest.
- Entwässern mit Isopropanol rein (Abspülen des schräg gestellten OT mit ca. 2 ml, ein mal 1 Minute Einwirkzeit, 2 mal Wechseln mit je 3 Minuten Einwirkzeit)
- Eindecken in Euparal

Bild 2.1: Übersicht W3A Färbung, Vergrößerung 25x, Einzelaufnahme


Bild 2.2: Gewebe und Leitbündel, Vergrößerung 200x, Stapel aus 6 Bildern


Bild 2.3: Pollinium und umliegendes Gewebe, Vergrößerung 200x, Stapel aus 5 Bildern

Hier zeigen sich Artefakte in den Zellen und in den Zwischenräumen, eventuell Bestandteile des Klebers, die mit angefärbt wurden?

3. W3Asim II (Alcianblau)

- Paraffinschnitt auf einem Objektträger aufgezogen
- Ausspülen des Paraffins mit Xylol (3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Überführen in Isopropanol (3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Ethanolreihe 100%, 70%, 50%, 30% (je 3 Minuten einwirken lassen, zwei mal Nachspülen mit kurzer Einwirkzeit)
- Spülen mit Aqua dest.
- Färben mit W3Asim II unverdünnt (Alcianblau 2%, Acriflavin 1% und Acridinrot 1% (in Ethanol 50%) im Verhältnis 3:2:2)
- Spülen mit Aqua dest.
- Entwässern mit Isopropanol rein (Abspülen des schräg gestellten OT mit ca. 2 ml, ein mal 1 Minute Einwirkzeit, 2 mal Wechseln mit je 3 Minuten Einwirkzeit)
- Eindecken in Euparal

Bild 3.1: Übersicht W3A Färbung, Vergrößerung 25x, Einzelaufnahme


Bild 3.2: Gewebe und Leitbündel, Vergrößerung 200x, Stapel aus 4 Bildern


Bild 3.3: Pollinium und umliegendes Gewebe, Vergrößerung 200x, Stapel aus 6 Bildern


Im Vergleich zur Dreifachfärbung kann sich der blaue Farbstoff bei den Simultanfärbungen an aufgezogenen Paraffinschnitten nicht richtig durchsetzen. Dies führt für W3Asim I zu Färbeergebnissen, wie sie bei klassischer Einzelfärbung frei schwimmender Schnitte zu erwarten sind, wenn dem letzten Färbegang mit Astrablau ein wenig Acriflavin zugegeben wird.
Die auch schon bei Rolf-Dieter Müllers Beispielfärbung erkennbare Tendenz ins grüne bei der Färbung mit W3Asim II setzt sich hier sehr stark fort, die Grundfarbe der Schnitte ist gelbgrün.

Bei den Simultanfärbungen konkurrieren die einzelnen Farbstoffe um die "Andockstellen" an den anzufärbenden Zellwänden.

Die Färbung entsteht bei den eingesetzten Farbstoffen entweder durch eine elektrostatische Anbindung entsprechend geladener Gruppen des Farbstoffmoleküls an Molekülgruppen der die Zellwand bildenden Stoffe mit entgegengesetzter Ladung. Eine weitere Möglichkeit ist die räumliche Anlagerung der Farbstoffmoleküle in passende "Lücken" in der Struktur der Zellwände. Diese zweite Form der Färbung ist stabiler als die rein elektrostatische Anlagerung. Die stärkste Bindung wäre eine chemische Reaktion der Farbstoffmoleküle mit Bestandteilen der anzufärbenden Strukturen unter Bildung eines neuen Stoffes, der dann fest in die Zellwand eingebunden ist.

Offensichtlich ist Acriflavin hier der beherrschende Farbstoff mit den besten und häufigsten Bindungsmöglichkeiten an die Strukturen der Zellwände. Nur bei in der Blüte seltenen lignifizierten Zellen kann sich Acridinrot durchsetzen und wird nicht vom Acriflavin verdrängt. Dies kann man auch schön bei der Einzelfärbung an frei schwimmenden Schnitten beobachten: diese sind zunächst gänzlich Rot gefärbt und werden vom Acriflavin in kürzester Zeit differenziert (das überschüssige Acridinrot geht in der Acriflavinlösung in Schwaden von dem Schnitt ab).   

In der hier getesteten Zusammenstellung ist der Anteil der blauen Farbstoffe Astrablau und erst recht Alcianblau zu gering, um einen deutlichen Blauton zu erreichen. Bei der Zusammenstellung W3Asim I gelingt jedoch in den Parenchymen eine schöne Differenzierung der Gewebe von blau nach grün, was in der Übersicht 2.1 an den angeschnittenen Coronarblättern gut zu erkennen ist.

Bei W3Asim II könnte ein angepasstes Mischungsverhältnis von z.B. Alcianblau 2%, Acriflavin 1% und Acridinrot 1% (in Ethanol 50%) im Verhältnis 4:1:1 eine Verbesserung bringen. Drei Objektträger mit Schnitten habe ich ja noch übrig.   :)

Herzliche Grüße
Jörg
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Rolf-Dieter Müller

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Liebe Mila, lieber Detlef, lieber Jörg,

vielen Dank für Eure Kommentierungen und ich bin selbst mit dem Ergebnis zufrieden, um dann für unsere Bonner Workshops immer eine schnelle und schöne Färbung zur Verfügung stellen zu können, zumal dann, wenn es thematisch nicht direkt um Färbungen geht, aber aus dem Thema heraus Dauerpräparte gemacht werden könnten.

@Jörg, vor einigen Tagen hatten wir ja eine spannende Maildiskussion zu Theorie und Praxis von Färbungen, insbesondere der Wackerfärbung. Mein geäußerter Zweifel, das die Simulatanfärbung auch auf Paraffinschnitte anspricht, muss ich hiermit revidieren.

Es ist schon beeindruckend, was Du geschafft hast und hier zeigst.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

Fahrenheit

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Liebe Pflanzenschnibbler,

hier nun Bilder von meinem letzten Färbeversuch (wieder der Blütenquerschnitt von Hoya carnosa, 10µm, aufgezogener Paraffinschnitt).

Da W3Asim II mit Alcianblau im alten Verhältnis 3:2:2 sehr gelblich ausgefallen ist, nun mit neuem Mischungsverhältnis
4 Teile Alcianblaulösung 0,2%  +
1 Teile Acriflavinlösung +
1 Teile Acridinrotlösung.

Die Mischung kommt wieder unverdünnt zum Einsatz.

Zum besseren Vergleich zeige ich zunächst die alte W3Asim II Färbung und direkt anschließend das gleiche Motiv in der neuen Variante.

Zunächst Gewebe und Leitbündel (Bilder 3.2 und 4.2):



Nun ein Pollinium (Bilder 3.3 und 4.3):



Wie man schön erkennen kann, dominiert das Acriflavin die Färbung nun nicht mehr so stark, die Rottöne sind jedoch noch sehr schwach.
Meine Acridinrot-Stammlösung ist mit 50% Ethanol angesetzt, was bei der Einzelfärbung vorteilhaft ist. Ich frage mich allerdings, ob der - wenn auch recht geringe - Ethanolanteil in der Simultanfärbung nicht zu einer unerwünschten Differenzierung des Acridinrots führt.

Das Ethanolproblem außer Acht lassend, würde ein Ansatz von Alcianblau, Acriflavin und Acridinrot im Verhältnis 5:1:2 wohl eine noch besser differenzierte Färbung ergeben. Dies gilt natürlich nur für das hier verwendete Material, das wegen seines geringen Anteils an verholzten Zellen sicher nicht das beste Beispiel für eine möglichst allgemeingültige Aussage zu den W3Asim - Färbungen ist.

Herzliche Grüße
Jörg 
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Rolf-Dieter Müller

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Neue Rezeptur für Wacker simultan var. Alcianblau
« Antwort #9 am: Juni 13, 2011, 00:08:31 Vormittag »
Liebe Mikrogemeinde,

für die beiden Farbgemische habe ich Acridinrot und Acriflavin im Überschuss beigestellt, was für nicht eingebettete Schnittfärbungen nicht kritisch ist, da der Überschuss mit sorgfältiger Entwässerung in Isopropylalkohol sicher ausdifferenziert wird. Jetzt hat aber Jörg (Fahrenheit) im vorhergehenden Beitrag gezeigt, das für Paraffinschnitte die Rezeptur angepasst werden muss.

Hierfür interessierte mich nun, wie die Färbung mit einem Minimum an Acridinrot und Acrifilavin reagiert, insbesondere W3Asim II, das ist die Wacker-Simultanfärbung var Alcianblau. Diese Variante gefällt mir persönlich am besten, weil sie nicht verholzte Zellstrukturen differenzierter darstellt. Dieses scheint für Alcianfarben typisch zu sein, so wie wir es vom bekannten und von Klaus Herrmann rezeptierten Etzold grün kennen.

Darüber hinaus habe ich die im Rasierklingenmikrotom frisch geschnittenen Schnitte in AFE fixiert. Dieses Verfahren hat Eckhard in diesem Beitrag sehr schön und übersichtlich dargestellt: http://www.photomacrography.net/forum/viewtopic.php?t=8349&start=0&postdays=0&postorder=asc&highlight=etzold . AFE fixiert einfach schneller, was besonders für Workshops vorteilhaft ist.

Nun zu meiner Rezeptur: Acridinrot und Acriflavin aus den Stammlösungen nach Wacker (hierfür bitte die Originalveröffentlichung im Mikrokosmos beachten, Quellenverweis im ersten Beitrag dieses Themas). 5 ml 0,1%ige Alcianblaulösung + 3 Pipettentropfen Acriflavin + 5 Pipettentropfen Acridinrot.

Das Ergebnis möcht ich nun mit nachstehenden Bildern präsentieren:








Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller

Fahrenheit

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Re: Wacker für alle – eine Simultanfärbung mit einem Farbgemisch aus Acridinrot ...
« Antwort #10 am: Juni 13, 2011, 09:20:07 Vormittag »
Lieber Rolf-Dieter,

tolle Schnitte, tolle Färbung und tolle Aufnahmen! Ich glaube, jetzt hast Du es!

Besonders beim Grashalm ist die Färbung wunderbar differenziert aufgezogen und auch beim Greiskraut kann man die Verbesserung gegenüber der schon guten ersten Präparation besonders am Rindenparenchym und der Epidermis deutlich sehen.

Einen Paraffinschnitt habe ich noch. Ich werde das neue W3Asim II Gemisch daran in den nächsten Tagen (oder vielleicht auch am Donnerstag in Deinem Workshop?) ausprobieren.

Herzliche Grüße
Jörg

p.s.
Den Grashalm hast Du aber nicht mit dem Haga-Mikrotom geschnitten ...  :o
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Eckhard

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Re: Wacker für alle – eine Simultanfärbung mit einem Farbgemisch aus Acridinrot ...
« Antwort #11 am: Juni 13, 2011, 09:27:39 Vormittag »
Guten Morgen Rolf-Dieter,

der Grashalm ist spektakulär!

Herzliche Grüsse
Eckhard
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Rolf-Dieter Müller

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Gräser schneiden und färben
« Antwort #12 am: Juni 14, 2011, 21:17:50 Nachmittag »
@Eckhard, mit spektakulär hast Du es aber sehr freundlich ausgedrückt. Ich selbst war über das Ergebnis etwas erschrocken, als wenn jemand einen ganzen Pastellfarbkasten durchprobiert hätte. Ich denke, für Gräser sollte man eine andere Färbung entwickeln.

@Jörg, ja, den Grashalm habe ich auch mit dem Rasierklingenmikrotom geschnitten. Das geht recht gut, besonders im Bereich und um den Knoten herum.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

Fahrenheit

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Re: Wacker für alle – eine Simultanfärbung mit einem Farbgemisch aus Acridinrot ...
« Antwort #13 am: Juni 19, 2011, 14:45:16 Nachmittag »
Lieber Rolf-Dieter,

ich bin nun nicht mehr ganz so erstaunt über die Möglichkeiten des kleinen Haga-Mikrotoms, wie ich es noch vor unserem Treffen am vergangenen Donnerstag gewesen wäre.  ;D

Liebe Pflanzenschnibbler und Färber,

Rolf-Dieter Müllers neue Färbung und auch seine Arbeit zum Haga Allmikro Mikrotom haben nun beide ihr Zuhause auf der Webseite des MKB gefunden.
Zu beiden Themen findet Ihr dort ausführliche Erläutzerungen, praktische Tipps und viele Beispielbilder.

Ich denke, ein Besuch lohnt sich: http://www.mikroskopie-bonn.de  :)

Herzliche Grüße
Jörg
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Anatol

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Re: Wacker für alle – eine Simultanfärbung mit einem Farbgemisch aus Acridinrot ...
« Antwort #14 am: Juni 22, 2011, 17:49:24 Nachmittag »
Hallo!

Lieber Rolf-Dieter und Jörg! Das ist Wonderful!!!  ;D

I May gefärbten Schnitten mit einer Mischung: 4 Teile Astrablaulösung + 2 Teile Acriflavinlösung + 4 Teile Acridinrotlösung  :)
gebeizt Tannine und Trichome  ;)

Querschnitt des Blattes Crassula namaquensis (Crassulaceae)

Foto 1.   100x, LOMO Mikmed 1



Foto 2   100x, Jenamed 2


TI – Idioblast mit Tannine
Tr – Trichome

Foto 3  100x, Jenamed 2, schräge Beleuchtung



Foto 4 200x, Jenamed 2, schräge Beleuchtung



Foto 5 100x, Jenamed 2, Polarisation, λ



Foto 6 Idioblaste mit Tannine, LOMO PlanApochromat 40x



Foto 7  GF Planachromat 40x, Jenamed 2




Herzliche Grüße
Anatoly
« Letzte Änderung: Juni 22, 2011, 18:00:22 Nachmittag von Anatol »
Herzliche Grüße

Anatoly