Ranunculus Leitbündel – Hellfeld und Phasenkontrast *

[Rolf-Dieter Müller]

Liebe Mikrogemeinde,

Phasenkontrast ist eigentlich nicht mein bevorzugtes Beleuchtungsverfahren, doch finde ich die Wirkung der Wackerfarben auch hiermit ganz nett.

Der nachstehende Querschnitte wurde mit dem Haga Mikrotom (Rasierklingenmikrotom) von einem sammelfrischen Blütenstängel geschnitten, in 70% Ethanol fixiert und mit den Wackerfarben Acridinrot, Acriflavin und Astrablau gefärbt. Der gefärbte Schnitt ist in Euparal eingeschlossen.

Weitere Hinweise zur Färbung sind hier beschrieben: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=9298.0

Beide Aufnahmen mit CP-Achromat 40x Ph2, Kamera Nikon D5000, Maßstabsbalken und Text mit AxioVision light eingefügt.





Interessant ist auch das Übersichtsbild dieses Schnittes, das ich in den nächsten Tagen zur Veröffentlichung auf der Webseite des Mikroskopischen Kollegiums Bonn (http://www.mikroskopie-bonn.de) einreichen werde.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller

[Roderich Römhild]

Das sind wirklich schöne Bilder von wirklich schönen offen kollateralen Leitbündeln. Glauben Sie, dass sich die Butterblumen auch als Frischpräparat von Hand schneiden lassen?

[Rolf-Dieter Müller]

...
Glauben Sie, dass sich die Butterblumen auch als Frischpräparat von Hand schneiden lassen?

Hallo Herr Römhild,

selbstverständlich kann man den Ranunculus Blütenstängel auch per Hand schneiden.

Um das Leitbündel zeigen zu können, muss es ja nicht unbedingt ein vollständiger Querschnitt werden, kleine dünne Fetzchen reichen vollkommen. Hierfür die Rasierklinge im flachen Winkel aufsetzen und die Klinge nur ziehend über den vorher mit einer scharfen Rasierklinge gerade geschnittenen Stängel führen.

Mit etwas Übung und frischen Rasierklingen gelingen sogar dünnere Schnitte als der hier gezeigte.

Viele Mikrogüße
Rolf-Dieter Müller

[-JS-]

Hallo Herr Müller,

vielen Dank für die Demonstration der Wacker simultan I - Färbung am Beispiel Ranunculus.
Ich finde die Darstellung im DL sehr schön ausgewogen und differenziert.

Das Phasenkontrastbild wirkt m.E. durch die aufgrund der Schnittdicke entstandenen Halos allerdings sehr unruhig und bringt meines Erachtens auch nicht viel mehr Information als das mit DL gefertigte - es ist aber als kleines optisches Experiment sicher einmal zeigenswert.

Zu der von Ihnen vorgestellten Simultan-Färbung habe ich noch eine Frage:
Soweit ich verstanden habe, werden die mit Rasierklingenmikrotom gefertigten Schnitte 'frei schwimmend' gefärbt und nach Entwässerung über 2-Propanol in Euparal eingebettet.
Welche Möglichkeiten gibt es, z.B. mit Hilfe von PEG1500 gefertigte Mikrotomschnitte für die Wacker-Färbung auf einen Objektträger aufzuziehen bzw. zu fixieren?
Bei Paraffin-Schnitten wird das Fixieren der Schnitte auf dem Objektträger ja z.B. mit Glycerin-Gelatine vorgenommen, und das Paraffin anschließend mit Xylol vom Schnitt entfernt.
Für PEG1500 habe ich bisher nur die Information, daß nach dem Schneiden das Einbettungsmittel in einer 20%igen Lösung von PEG in Wasser vom Schnitt zu lösen und den Schnitt erst anschließend in reines Wasser zu überführen ist, um so eventuell mögliche Zerstörungen des Schnittes durch Lösungsprozesse zu vermeiden.
Ich würde aber ganz gern den Kampf mit 'frei schwimmenden' Schnitten umgehen wollen - daher die Frage nach einem für PEG-Einbettung geeigneten Kleber.

Viele Grüße
Joachim

[sirdul]

Hallo Joachim,

hast Du mit der Methode die Schnitte zuerst in eine 20%  PEG/Wasser Lösung zu überführen und anschließend in reinem Wasser zu überführen hinsichtlich der Vemeidung von Zerstörungen positive Ergebnisse erzielt ?
Für die Schnitte Fixierung ist mir leider keine Lösung bekannt.

Gruß aus Oberfranken

Ludger Benning

[-JS-]

Hallo Ludger,
ich habe mit PEG als Einbettungsmittel bisher nur sehr wenig Erfahrung sammeln können.
Den Tipp mit dem Trennen der Schnittblockmasse in einer Lösung von PEG in Wasser
statt in reinem Wasser ist sowohl hier

Jentzen A (1988): Erfahrungen mit Histowachs. Mikrokosmos Band 77, Seite 57

Die Schnitte überführt man in Wasser, in dem sich das Histowachs sofort löst.
Zarte Gewebe können dabei zerreißen (Oberflächenspannung des Wassers!)
Man verhindert das, indem man dem Wasser einige Schnitzel Histowachs zusetzt.

als auch hier

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4265.0

Die Schnitte legt man in 10 % ige PEG Lösung, damit sich das PEG nicht zu rasch wieder auflöst
und dabei den Schnitt beschädigt. Querschnitte von Flechten kann man ohne weitere Färbung in Euparal
einschließen und dann untersuchen.

nachzulesen. Es tut mir leid, aber die Zahl 20%ige Lösung von PEG in Wasser aus meiner früheren
mail war - da aus der Erinnerung geschrieben - nicht korrekt.
JENTZEN schreibt, daß Schnitte welche in PEG eingebettet waren, sich 'nur mit Mühe' auf dem
Objektträger fixieren lassen.
Dieser Satz war der Grund für meine Frage an Rolf-Dieter Müller (sowie natürlich auch an
die restliche 'schnippelnde Zunft'...):
Vielleicht kennt jemand ein geeignetes Fixiermittel auf Objektträger für Mikrotomschnitte aus
PEG-Blöcken?

Viele Grüße
Joachim

[Fahrenheit]

Lieber Joachim,

zunächst zu den PEG Schnitten. Wie dick sind die denn? Bei hinreichend stabilem Material würde ich mir die Mühe mit dem Aufkleben nicht machen - die Färbung im Uhrglas (wie von Eckhard vorgeschlagen) ist einfach, geht schnell von der Hand und verbraucht sehr wenig Reagenzien.

Du brauchst zwei bis drei Uhrgläser (8 cm, in der Regel reicht eines) und Pipetten mit dünner Spitze (ich nehme die kleinsten Einmalpipetten). Die Schnitte bleiben im Uhrglas (Du bekommst sie mit einem feinen Maderhaarpinsel Größe 000 da hinein ...) und die Reagenzien werden nach einander mit der Pipette zugegeben und wieder abgesaugt. Zum Schluss werden sie wieder mit einem feinen Pinsel (aber einem Frischen!) auf den Objektträger übertragen, mit Harz bedeckt und eingeschlossen.

Lieber Rolf-Dieter,

das sind schöne Bilder! Gut zu sehen, dass die W3Asim - Färbungen so gut funktionieren und was Du aus dem Haga-Mikrotom raus holst, grenzt für mich an ein Wunder.
Ich freue mich auf Deinen Bericht für die Webseite des MKB.

Allen herzliche Grüße
Jörg

[-JS-]

Lieber Jörg,
vielen Dank für Deine Tipps.
Die Schnitte sollen (wenn es mein betagtes Jung-Rotationsmikrotom aus Heildelberg denn zulässt)
so zwischen 30 und 40 µm dick sein.
In Paraffin-Bettung haben wir vor Urzeiten mit gleichem Gerät wesentlich dünner geschnitten, aber ich
möchte die ganze Entwässerungs- und Einbettungsprozedur, insbes. die nötige Verwendung von Xylol eben
liebend gern vermeiden.
PEG1500 bietet ja außerdem den Vorteil, wegen seines hydrophilen Charakters nahezu natives Material
einbetten zu können - hier sind höchstens Artefaktbildungen wegen der notwendigen Erwärmung auf
40 - 55°C zu erwarten.
Deine Uhrglasmethode werde ich im weitesten Sinn auch anwenden, allerdings unter Zuhilfenahme
von 35mm-Petrischalen und einigen 250µl-Hamiltonspritzen, die ich noch aus meiner analytischen
HPLC-Zeit bei mir herumliegen habe.
Ich mag diese kleinen Gehilfen lieber als die Einmalpipetten, weil sie sich leicht reinigen lassen,
sehr dauerhaft in der Anwendung sind und weil sie (nahezu) unverwüstlich sind.
Allerdings mögen sie freien Fall aus Tischhöhe auf Kachelfußboden so gar und *überhaupt* nicht
leiden...
Die Sache mit dem Oachkoatznschwoaf-Pinsel 000 kenne ich auch noch, das ist aber sooo lange
her, dass ich kaum noch weiss, wo man heutzutage Derartiges her bezieht. Ich sehe aber ein, dass
selbst die Verwendung einer Belzer-Feinpinzette für die geplante Schnitt-'Dicke' in Zusammenhang
mit zittriger werdenden Händen ein ernstzunehmendes Problem darstellt. Gehe ich also hin und
suche adäquaten Künstlerbedarfshandel auf... (hier in der Schwalm?? ...hmmm...)
Jörg: Nochmal vielen Dank für die Tipps.
Herzlichen Gruß
Joachim

[Rolf-Dieter Müller]

Hallo Joachim,

jetzt sind wir schon bei der PEG-Einbettung, die ich eigentlich im zweiten Schritt meiner geplanten Workshop-Reihe für das Mikroskopische Kollegium Bonn zum Thema Schneiden mit dem Rasierklingenmikrotom einführen werde.

Aber im Vorgriff kann ich doch schon einmal zu den hier aufgeworfenen Fragen einiges bemerken.

1. Wenn überhaupt, würde ich das Sammelwasser nur mit ganz wenig, oder gar nicht mit PEG anreichern. Gerade beim Mikrotomschneiden fallen soviel Schnitte an, das nach dem Lösen der ersten Schnitte der Konzentrationsausgleich vernachlässigbar ist. Ich verwende das Sammelwasser ohne PEG, wenn Sie aber möchten, dann deutlich unter 10%.

2. Wenn Sie die PEG-Schnitte aufkleben möchten, gibt es eine sehr schöne und sichere Methode, die ich als "Klosterschüler" bei Dieter Krauter und Heinz Streble kennengelernt habe. Kurz zusammengefasst, auf einem mit dünner Glyzeringelatine beschichteten Objektträger wird der Schnitt aufgezogen und über Formoldämpfe "bombenfest" und vor allen Dingen plan festgeklebt. Eine ausführliche Beschreibung des Verfahrens finden Sie in der Mikrofibel von Klaus Henkel ab Seite 181 ff.

Ich selbst klebe meine Schnitte nicht auf, da ich keine weiteren optisch wirksamen Medien in meinen Präparaten habe möchte.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller

[-JS-]

Hallo Herr Müller,
vielen Dank für diese Hinwweise.
Zweifellos dürfte das Wegbleiben von durch Schnittfixierungsmittel verursachten Gefahrenquellen
von Artefaktbildungen im Vordergrund stehen.
Damit werde ich mich dann also der bereits von Jörg Weiß empfohlenen Methode mit dem
Marder- bzw. Eichhörnchenschwanzhaarpinsel der Größe 000 auseinanderzusetzen haben.
(Und damit selbstredend sowie auch zwangsweise den Kampf mit frei schwimmenden Schnitten
entgegentreten müssen ...)
Viele Grüße
Joachim

[Rolf-Dieter Müller]

...
das sind schöne Bilder! Gut zu sehen, dass die W3Asim - Färbungen so gut funktionieren und was Du aus dem Haga-Mikrotom raus holst, grenzt für mich an ein Wunder.
...

Lieber Jörg,

vielen Dank.

Ich denke mit der Färbung und dem Schneiden mit dem Rasierklingenmikrotom können wir für weniger in mikroskopische Technik Geübte ein Verfahren anbieten, um einfach und schnell zu eigenen vorzeigbaren Präparaten zu kommen.

Gut, das kleine Mikrotom wird natürlich in der Anwendung auch Grenzen haben, aber die kann ich erst formulieren, wenn ich die auch erreicht habe. Bis dahin sehe ich in dem Gerät noch einiges Potential.

Für unseren Workshop bleiben wir erst einmal bei Sprossquerschnitten von krautigen Pflanzen. Vorher werde ich aber noch Noname-Rasierklingen gegen ein bekanntes Markenprodukt testen, gerade wenn es in die letzten Feinheiten geht, ist hier die Qualität nicht zu vernachlässigen.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

[Rawfoto]

Guten Morgen

Ich bin bezüglich PEG überhaupt noch nicht schlau geworden. Wo z.B. bezieht man PEG, und wie genau wird das verarbeitet. Über die Suche bin ich auf einen Tread von Hr. Henkel (ich hoffe ihn richtig geschrieben zu haben) gestossen. Dort wird das für Pflanzen aber eher als nicht sinnvoll abgetan ...

Leider liegt Euer Workshop für Wiener weit weg, der würde mich auch interessieren. Wenn Ihr einen mehrtägigen hättet (verlängertes Wochenende & und nicht im Mai/Juni), das würde ich dann als Traum bezeichnen :-))

Was bedeutet eigentlich PEG, sprich die Abkürzung?!

:-)

Gerhard

[RainerTeubner]

Hallo Gerhard,

PEG ist die Abkürzung für Polyethylenglycol.

Der Artikel in der Wikipedia ist sehr gut: http://de.wikipedia.org/wiki/Polyethylenglykol

Viele Grüße

Rainer

[Rawfoto]

Hallo Rainer

Besten Dank, topp allgemeine Beschreibung, das hilft schon Mal fuer den Ueberblick und fuer die Suche nach Bezugsquellen ...

Was mir jetzt noch fehlt ist eine Einsatzbeschreibung fuer Pflanzen ...

:-)

Gerhard

[-JS-]

Hallo Gerhard,

Was mir jetzt noch fehlt ist eine Einsatzbeschreibung fuer Pflanzen ...

von Ralf Wagner gibt es zum Thema PEG (aka "Histowachs") eine sehr gute Zusammenfassung als Powerpoint-Präsentation hier:
http://www.dr-ralf-wagner.de/Forum/PEG.pdf

Mike Guwak stellt in eine kurze Anleitung hier vor:
http://blforum.mikroskopie-main-taunus.de/index.php?option=com_content&view=article&id=10&Itemid=30&lang=de

In Ralf's und Mike's Artikel finden sich im jeweils anhängenden Literaturverzeichnis auch weiterführende Hinweise.

Es gibt noch andere Dokumentationen, diese können aber aus rechtlichen Gründen hier leider nicht öffentlich gemacht werden.
Bei Bedarf bitte PN.
Viele Grüße
Joachim