Autor Thema: Histologie Schilddrüse, Pancreas und Ovarium  (Gelesen 24733 mal)

Ralf Feller

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Re: Histologie Schilddrüse, Pancreas und Ovarium
« Antwort #15 am: Juli 13, 2009, 23:54:38 Nachmittag »
Hallo Herr Schulte,
auch von mir nochmal herzlichen Dank für die tolle Darstellung, die sollte wirklich in die Mikrorezepte!

@Jürgen Harst
Ja Ja genau das mit den Entwässerungszeiten habe ich mich auch gerade gefragt. Ich entwässere auch im 2-4h Takt, vielleicht erklärt das die Schrumpfungen??? Ich ging dabei auch davon aus, dass meine kleinen Mücken nicht so lange brauchen, aber vielleicht ist das ja ein Irrtum.

Übrigens zur Prozedur des Einbettens:
Ich verwende ein großes Wasserbad mit Einhängethermostat und Rührmotor ab der Stufe Xylol/Paraplast 1+1 bei 70C. In den Wasserbad befindet sich ein Reagenzglasständer und ein Kolben mit den geschmolzenem Paraplast. Ich nehme die Proben nicht aus den Röhrchen sondern pipettiere mit sehr weitlumigen Plastikpipetten immer um. Lässt man die Pipetten im geschmolzenen Paraplast gehen sie auch nicht zu, sonst aber auch kein Problem, sind Einmalartikel. Wenn ich fertig bin (kein Xylolgeruch mehr) härter die Probe von unten nach oben, dann kann ich mit einer langen Nadel noch die Probe einstellen. Achtung, in Röhrchen bildet sich ein langer Paraffinnabel weil das Paraffin beim erkalten an Volumen abnimmt, man muß sehr hoch aufgießen, aber das Material kann ja später wieder eingeschmolzen werden.

Allgemein denke ich, ich habe noch viel an Fixierung (ev. aufschneiden vor dem Fixieren, meine Hirnschnitte sind nicht optimal fixiert) und Entwässerung zu arbeiten.

viele Grüsse,
Ralf Feller

Ralf Feller

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Re: Histologie Schilddrüse, Pancreas und Ovarium
« Antwort #16 am: Juli 14, 2009, 00:18:23 Vormittag »
Mir fällt nur gerade ein,
wenn Sie Zeit finden und schöne Schnitte haben, würde ich sehr gerne etwas vom Fisch oder der Fliege sehen bitte?
Gruss nach Holland

Jürgen H.

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Re: Histologie Schilddrüse, Pancreas und Ovarium
« Antwort #17 am: Juli 14, 2009, 17:00:57 Nachmittag »
@ Ronald: Dem Wunsch von Ralf Feller schließe ich mich sofort an!

@ Ralf Feller

Lieber Ralf Feller,

 Herr Langer aus diesem Forum hat mir einmal per PN die Zeiten seiner Spinneneinbettung geschickt:

2 Wochen Bouin (Objekt anschneiden, anstechen o.ä., damit B. eindringen kann!)
90% Alkohol -> 1 Tag
90% Alkohol -> 1 Tag
96% Alkohol -> 2 Tage
100% Alkohol -> 1 Tag
Isopropanol - > 1 Woche
Butanol 3x je 3 Tage

Ganz wichtig erscheint mir, eine Körperöffnung zu schaffen, auch wenn das Tier Stigmen hat. Ich entferne regelmäßig die Beine an den Coxen.

Die Zeiten von Herrn Langer stimmen ja so in etwa mit denen von Ronald überein, vielleicht sollten wir wirklich unsere Zeiten verlängern, wobei ich allerdings lieber bei Iso bleiben möchte, den Ethylalk. vermeiden möchte. Zu langes Verweilen in hochprozentigem Ethylalk. soll stark härten (womit Ronald bei seinen Weichteilen wahrscheinlich weniger ein Problem hat)

Verblüffend erscheint mir die Butanolbehandlung am Schluss, ich nehme an, es ist N-Butanol.

Ich habe allerdings immer wieder in der Literatur gelesen, dass kleinste Wasserreste vor dem Paraffinbad fürchterliche Auswirkungen haben soll....Möglicherweise ist letzteres der Grund für die eingehende Butanolbehandlung...  

Mikrogrüße

Jürgen






« Letzte Änderung: Juli 14, 2009, 17:05:19 Nachmittag von Jürgen Harst »

Ronald Schulte

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Re: Histologie Schilddrüse, Pancreas und Ovarium
« Antwort #18 am: Juli 14, 2009, 20:08:29 Nachmittag »
Die Zeiten sind auch für gewebestücke bedacht. Ein Kleinen biopt zum Beispiel braucht nur ein paar Stunden. Die 12 und 24 schritte passen auch schön in Tag und Nacht ritme. Schnell für die Arbeit wechseln und abends wider den nächsten Schritt. Material öffnen ist wichtig und manchmal sogar notwendig. Wenn alle Chemikalien durch die epithelzellen passieren sollten geht das nicht, dann bleibt sicher Wasser im Gewebe und das mischt nicht mit paraplast.
Schrumpfartefakte entstehen auch bei zu schnellen concentrationsanstieg (ist das Deutsch!). Darum fange ich meist an mit 50% und dann 70%. Wenn man zu schnell steigt entstehen Artefakte.
Xylol macht das Gewebe hart so muss Mann empirisch feststellen was die richtige zeit ist. Lunge oder Gehirn ist nicht so schlimm weil das schon sehr sanft ist aber zum Beispiel Leber wird schnell wie ein Stein und last sich dann kaum mehr schneiden. Natürlich ist Isopropanol auch prima aber ist nicht so Schnell wie Ethanol.
Rechne mit ein durchdringingsverfahren von eine Millimeter pro Stunde für Ethanol (Zimmertemperatur).
Diesen Herbst schreibe ich ein kleinen Histokurs mit besseren aufnahmen und wird das dann hier im Forum Posten. Wird auch im .pdf gemacht so das es herunter zu laden ist.
Bilder von der Fliege und Darm geht nicht mehr. Hab sie mit Entellan eingegossen und das war ein Größen Fehler, alles ist gerissen. Jetzt nehme ich nur noch Euparal oder Malinol und das ist viel besser.
Jetzt mal ein paar Wochen Urlaub.

Grüße Ronald
Mikroskope:
2x Leitz Orthoplan (DL, AL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotome:
A&O 820 Rotationsmikrotom.
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.

CaDi

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Re: Histologie Schilddrüse, Pancreas und Ovarium
« Antwort #19 am: Juli 14, 2009, 23:23:34 Nachmittag »
Hallo Ronald,

vielen Dank für den ausführlichen Bericht, davon werde ich noch lange zehren.

Ich strecke die Schnitte so:
(sehr schwer zu streckende Schnitte, faltenanfällig)
- Schnitt auf einen Objektträger legen (ohne Flüssigkeit)
- Mit 30-70% Ethanol langsam vorstrecken ( mit einer Pipette vorischtig hinzugeben). Dabei den Objektträger schief halten, damit sich (durch die aber schon herabgesetzte) Oberflächenspannung ein kleiner Berg bildet, der sich den Schnitt nach oben zieht. (habe ich von einem youtube-Video, Histotechniques oder so)
Mit etwas Übung kann man fast jeden Schnitt damit bändigen. Man kann das auch mit Wasser machen, da wird der "Berg" noch größer, das kriecht aber nicht so gut unter den Schnitt.
- Das Ethanol muss vor dem Vorstrecken im kalten Wasser noch schrittweise durch Wasser ersetzt werden, sonst zerreißt er aufgrund der Diffusionsströme. Also entweder absteigende Konzentrationen oder etwas Wasser an eine Seite und warten, vorsichtig schwenken, ausprobieren.

(bei normalen bis sehr guten Schnitten)
- Schnittbänder von 2-ca. 20-25 Schnitten mit zwei Pinseln an beiden Enden in einem kalten Wasserbad vorstrecken. Dabei am besten einen dicken Pinsel benutzen der schön haftet. Mit dem dicken Pinsel das lange Bandende hochhalten und während des Streckens senken bzw. das Band "abdrehen" um etwas die Spannung vom Band zu nehmen.
- Mit Präpariernadeln, Pinseln etc. einzelne Schnitte lösen und die Objektträger beladen.

Wenn ich nächste Woche mal Zeit habe werde ich einige Bilder davon machen.

Viele Grüße,
Carsten