Autor Thema: hat mäusegehirn eine eigenfluoreszenz??  (Gelesen 4155 mal)

amaretto

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hat mäusegehirn eine eigenfluoreszenz??
« am: August 18, 2011, 12:33:56 Nachmittag »
hallo !

ich weiß nicht , ob mir das hier einer sagen kann, aber es wäre schon schön! und zwar färbe ich mäuseembryonen der tage 8,9,10 und 13 auf indian und sonic hedgehog. die immunhistochemie hat schon recht gut funktioniert, aber wir wollten dann doch noch immunfluoreszenz bilder machen. nun habe ich aber festgestellt, dass meine positiv-kontrollen (bei sonic und indian hedgehog ist das gehirn) sich ebenso wie die negativ kontrollen (ohne 1.ak) anfärben. ok, die positiv kontrollen sind an ein paar stellen intensiver gefärbt, aber müsste nicht die negativ kontrolle wirklich negativ sein?? meine betreuerin meinte was von eigenfluoreszenz des gehirn bei der wellenlänge des verwendeten farbstoffes (fluorescein) und dass ich mal nen andren ausprobieren soll. aber ich hab zu eigenfluoreszenz nichts gefunden.....

und falls jemand von euch nen tipp hat wie ich meine tag 13 embryonen schön komplett knochen-knorpel färben kann wäre ich auch nicht abgeneigt...hab schon mehrere protokolle ausprobiert..die färbung und auch der verdau funktionieren gut, aber sobald die aufsteigende glycerin reihe kommt schrumpfen mir die embryonen wech und ich kann sie nicht mehr schön fotographieren und knochen und knorpel sieht man auch net mehr...nur noch ne blaune schrumpel-masse...das is echt schade...

und wenn keiner nen tipp hat: trotzdem danke fürs lesen!^^

Klaus Herrmann

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Re: hat mäusegehirn eine eigenfluoreszenz??
« Antwort #1 am: August 18, 2011, 12:47:10 Nachmittag »
na Ronalds super Darstellung könnte dir im Prinzip helfen

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=3881.0

Wobei ich fürchte, dass für deine Immunfluoreszenz die Fixierung nicht geeignet ist. Wie gehst du da vor?

Und kannst du nicht mal ein paar Bilder zeigen - soll ja angeblich mehr sagen als 1000 Worte quatschen ;)

Auch Bilder der Fehlversuche sind wichtig!

Wie man Bilder einstellt steht hier oben im allgemeinen Teil. Viele verwenden als Host www.photobucket.com

Noch ne Verständnisfrage:
Zitat
auch der verdau
was ist das?
« Letzte Änderung: August 18, 2011, 12:51:02 Nachmittag von Klaus Herrmann »
Mit herzlichen Mikrogrüßen

 Klaus


ich ziehe das freundschaftliche "Du" vor! ∞ λ ¼


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purkinje

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Re: hat mäusegehirn eine eigenfluoreszenz??
« Antwort #2 am: August 18, 2011, 13:47:32 Nachmittag »
Ja, die negativ Kotrollen müssen sein, spätestens wenn du es publizieren willst!
Es gibt zu viele Möglichkeiten der unspezifischen Färbung bei der Immunhistochemie generell.
Es gibt bei Gehirn eine geringe Eigenfluoreszenz, im adulten Gewebe durch Ablagerungen meist stärker, diese hat aber im Falle der Fluorescein verwendeten Filter eine orange anmutende Emission.
Einfach die am besten hintereinanderliegenden Schnitte +/- 1. AK mal fotografieren; in der Nachbearbeitung identisch Farbkanäle bzw. Helligkeit wegnehmen und sehen ob bei den + Signal übrigbleibt, falls ja -und den Eindruck hattest du ja- diese Schnitte noch einmal mit geringerer Anregungsintensität ablichten.
Ursache für einen (zu hohen/ höheren "Hintergrund" in Negativkontrollen ohne 1.AK) kann auch der 2.AK sein (vielleicht sogar in Maus oder Ratte gewonnen?), zu den Kreuzreaktivitäten  mal das Datenblatt oder die Fa. konsultieren. Vieleicht hilft auch verkürzen der Fluorescein-gekoppelten Rkt, längeres waschen danach (pH -Wert auch der Waschlösung einstellen!), etc.
verwendest du überhaupt einen 2.AK? Ist dieser direkt Fluorescein- gekoppelt oder noch ein Schritt dazwischen (Streptavidin-gekoppelt? Im Hirn gibt es relativ viel Biotin zum kreuzreagieren )?
Kann mich nur anschließen : ein Bild und das genaue Protokoll wären hilfreich;
Zu Knochen-u Knorpelfärbungen kann ich ich als alter Hirnschnippsler nichts beitragen  ;D
LG
« Letzte Änderung: August 18, 2011, 13:58:27 Nachmittag von purkinje »
Beste Grüße
Stefan

Ronald Schulte

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Re: hat mäusegehirn eine eigenfluoreszenz??
« Antwort #3 am: August 18, 2011, 19:26:16 Nachmittag »
'amaretto' ??? Nette Name für ein schöne Beilage zum Cappuccino :)

Ich weis wenig von immunhistochemie und nichts von immunfluoreszenz. Was ich wohl weis sind Färbungen durchgeführt an Theiler Stage 24 Mauser.
Kennst du diese Website auch: http://www.emouseatlas.org/emap/home.html.
Wenn du Knochen und Knorpel Färben möchtest für die durchlicht Mikroskopie dann kann ich sicher einiges Empfehlen.
Mit den gänglichen HE lässt sich bei mir das Knorpel auch nicht schön Färben (Bild1), aber Mitosen und Blutzellbildung ist Fantastisch.



Wenn ich aber Färbe mit:
- Kernechtrubin/Anilin-OrangeG-Eisessig;
- Mallory 1900;
- AZAN nach Ronald Schulte;
- PTAH (Phosphotungstic Acid Hematoxylin)
Dann sieht es aber gut aus.

Kernechtrubin,


PTAH,


Wenn du die Rezepte gerne haben möchtest dann melde dich bitte nochmals.

Die Schrumpfungen sind natürlich einbettungsbedingt. Das wird immer bleiben nur ein  '...nur noch ne blaune schrumpel-masse...' kenne ich gar nicht.
Beschreibe mal dein einbettprotokol.

Wenn du kein oder nur sehr wenig Schrumpfung möchtest dann ist eine Einbettung in Technovit eine sehr empfehlenswerte Methode.
Vielleicht wäre da ein Tausch zu machen: "du lieferst mir die Formol Fixierte Embryonen und bekommst fertig gefärbte Präparaten wider zurück".

Grüße aus Franeker, Ronald
Mikroskope:
Leitz Orthoplan (DL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotome:
A&O 820 Rotationsmikrotom.
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.

Holger Adelmann

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Re: hat mäusegehirn eine eigenfluoreszenz??
« Antwort #4 am: August 18, 2011, 19:45:17 Nachmittag »
Viele Gewebe zeigen eine Eigenfluoreszenz im UV Bereich.
Wenn also das Anregungsfilter zu breitbandig ist kommt es der Immunhistochemie oft zu der unerwünschten Hintergrundfluoreszenz.
Zusätzlich zu den bisherigen Anregungen würde ich den verwendeten Filtersatz auf Schmalbandigkeit / UV Unterdrückung untersuchen.

VG
Holger