Guten Morgen zusammen,
ich hab wieder eine super Frage... 8)
Ich bin nun endlich mal beim Paraffineinbetten angekommen, und wollte die Isomethode von Klaus Henkel ausprobieren. Nun stellt sich mir beim Schritt vom Iso ins Paraffin die Frage: das mischt sich ja überhaupt gar nicht??? Iso4 mit Probe als auch Paraplast (Schmelzpunkt 56°) waren eine Stunde bei 62° im Wärmeschrank, es relativ wenig weil ich nur ein kleines Stückchen Material habe, es sollte also alles schön gleich warm gewesen sein. K.H geht wenn ich richtig verstanden haben von 45°Iso ins 63° heiße Paraffin, aber da sollte es sich aber dann noch schlechter mischen?
Auf jeden Fall, gestern das heiße Iso ins heiße Paraffin gekippt, kräftig umgeschwenkt, wird schön trüb, Probe dazu, schwimmt plötzlich oben (war im Iso noch unten), weiter schwenken, PRobe irgendwann unten, zurück in Wärmeschrank, und mangels schlechter Zeitplanung (bzw wußte ich nicht daß Paraffin sooooooo lang braucht bis es schmilzt...) erstmal nach Hause, heißt das Zeug stand da nun über nacht. und heut früh mach ich den SChrank auf, habe zwei fein säuberliche Phasen, und mein GEwebe schwimmt ganz oben im Isoprop... :-\ Das kann ja wohl irgendwie nicht stimmen. Oder doch?!?!?
Ich mein, ich hab hier genug Rotihistol, bzw wenn ich suche finde ich vermutlich sogar irgendwo "richtiges" Xylol, um den "klassischen" Weg zu probieren, aber da in diversen QUellen wie zB auch im Romeis steht, daß es mit Isopropanol alleine auch klappen soll, frage ich mich eben, ob das vielleicht so muß wie es ist?
Für Tips und Erhellung dankbar! :)
Nora
Hallo,
vorweg: du könntest Dir für meinen Geschmack etwas mehr Mühe bei der Formulierung des Beitrages geben, den Text muss man schon drei mal lesen, bis sich der Sinn erschließt. Das ist nicht böse, meckrig oder besserwisserisch gemeint, ehrlich.
Du schreibst gar nicht, was für Isopropanol du verwendest. Wie alt, woher, welche Qualität und vor allem: Wie viel Wasser ist drin? Eigentlich löst sich meiner Erfahrung nach Paraffin recht gut in heißem Isopropanol, wobei meine Erfahrung chemischer und nicht histologischer Natur ist. Es muss aber schon recht trocken sein.
vlg
Timm
Danke für die Antwort!
Ich gebe zu, ich hab den Beitrag etwas eilig geschrieben, weil ichs noch vor dem nächsten Termin loswerden wollte, und für mich die ich grad mitten in der Materie drinstecke ist natürlich alles völlig klar... 8)
Ich habe jetzt heut früh die Mischung (20 + 20ml) nochmal bis zur Trübe umgeschwenkt (ich habs in so einer Blaudeckellaborflasche http://www.ehlert-partner.de/BILDER/LABFLasch.jpeg ), und so schaut es jetzt immernoch aus, also trüb, und das Gewebe ist wieder unten. Ist das jetzt richtig so? Vielleicht war es gestern dann doch einfach noch nicht gleichmäßig temperiert??
Mein Isoprop kommt aus einer frisch geöffneten, für noch nichts anderes und niemand anderem benutzten Flasche Rotipuran>99,8% p.a., viel Wasser sollte und kann da eigentlich gar nicht drin sein.
Bin mal gespannt wie sich das entwickelt.
Falls jemand noch grundsätzliche Tips zum Paraffineinbetten hat, gerne. Den Faden von Herrn Schulte kenne ich allerdings.
Ein update:
Ich hatte beschlossen daß die Trübung wohl richtig so ist, und hatte nun die Flasche etwa 1min bei RT, um die Probe rauszufischen und in reines Paraffin zu überführen. Stimmt, dann hab ich sie noch beschriftet, also noch mal 30sec dazu, und wieder zurück in den Wärmeschrank gestellt um später zu überlegen was ich damit mache. Nun hab ich zufällig nochmal in den Schrank geschaut, und es sind wieder zwei klare Phasen?! Es kann ja jetzt wohl nur ein minimaler Temperaturunterschied zu vorher sein, aber ich vermute hier die Ursache. Vielleicht sollte ich mal ein Thermometer in den Schrank legen, ob der wirklich die 62° hat die er anzeigt? Im Romeis steht die 1:1Mischung auch bei "nur" 60°, und scheint sich trotzdem zu mischen. Ich rätsle weiter.
Grüße,
Nora
Hallo Nora
Paraplast enthält neben Paraffin noch verschiedene Kunststoffanteile. Ich nehme an, dass es allein aus diesem Grunde Trübungen oder Ausflockungen mit Paraplast gibt. Klaus Henkels Anweisungen dürften sich jedoch auf reines Paraffin beziehen.
Ralf Feller hatte in der Vergangenheit einmal einen Versuch zur Löslichkeit von Paraplast in Iso gestartet. Sieh einmal hierzu und auch im Übrigen zur Paraffineinbettung:
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4091.0
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo,
ich habe genau die gleichen Erfahrungen mit Paraplast gemacht.
Und als Chemiker weiß ich auch, wie man IPA trocknen kann.
Ich habe früher mit Kerzenwachs-Paraffinöl Mischungen gearbeitet und mit den Schmelzpunkt so eingestellt wie ich ihn brauchte. Da funktionierte es mit IPA, selbst wenn es noch 1 % Wasser enthielt.
Mein Paraplast liefert definitiv 2 Phasen mit Isopropanol (IPA).
Ich gehe davon aus, dass es sich nicht mehr um Paraffine handelt bei einigen Paraplastsorten
LG
Sascha
Zitat von: Jürgen H. in Januar 13, 2015, 17:52:09 NACHMITTAGS
Paraplast enthält neben Paraffin noch verschiedene Kunststoffanteile. Ich nehme an, dass es allein aus diesem Grunde Trübungen oder Ausflockungen mit Paraplast gibt. Klaus Henkels Anweisungen dürften sich jedoch auf reines Paraffin beziehen.
Jürgen
Hallo Jürgen!
Nein das tun meine "Anweisungen" nicht. Wie kommen Sie denn darauf? Seit vielen Jahrzehnten schon ist die Verwendung von reinem Paraffin für Einbettungen nicht mehr üblich. Alle modernen Paraffinmischungen enthalten auch andere Anteile, z.B. um es geschmeidig zu halten. In meiner Amleitung habe ich das genau geschrieben:
Wenn in den folgenden Detaildarstellungen Paraffin oder reines Paraffin erwähnt ist, so ist damit immer eine der
arbeitserleichternden, modernen Paraffinmischungen gemeint, die aus reinem Paraffin und verschiedenen
plastischen Polymeren von bestimmten Molekulargewichten bestehen. Die letzten verbessern die Einbettungsund
Schneideeigenschaften gegenüber reinem Paraffin wesentlich. Das vorherige ,,Altern" des Paraffins durch
starkes Erhitzen im Thermostaten, wobei giftige Dämpfe entstehen, wie auch das anschließende Filtrieren und
Beimischen von Bienenwachs sind nicht mehr notwendig. Man wählt einfach eine moderne Paraffinmischung
mit Schmelzpunkt zwischen 54-60°C, vorzugsweise 55- 58°C.@ Nora: In Ihrer Beschreibung der Prozedur kann ich die Schritte, die Sie aufzählen nur schwer und unsicher in einen Zusammenhang bringen mit den Prozeßschritten, die ich in meiner Anleitung mit Großbuchstaben bezeichnet habe. Würde es Ihnen etwas ausmachen, das zu ergänzen? Ich bin mir sicher, daß wir den Fehler finden können.
Grüße
KH
Hallo Herr Henkel,
als ich meine Vermutung äußerte, dass Sie nur reines Paraffin meinen "dürften", kannte ich nur diesen Aufsatz hier:
http://www.klaus-henkel.de/paraffin-intermedien.pdf
Entschuldigen Sie Bitte, dass ich nicht Ihre Ansicht getroffen habe.
Ich habe zur Zeit einenkleinen Versuch laufen, da mich die S ache nun doch näher interessiert.
Ich habe je eine Mischung von Merckschen Paraffin56/58 und von Paraplast plus Mc. Cormick mit über Molekularsieb getrocknetem Iso 1 zu 1 hergestellt und im Wärmeschrank auf 60 Grad gehalten. Es bilden sich in beiden Fällen klare Lösungen von Paraffin und Iso . Es zeigen sich weiterhin in beiden Fällen deutliche Phasengrenzen, die darauf hinweisen, dass keine Vermischung der Stoffe stattfindet. Schüttele ich die Gläschen mit einer im Wärmeschrank vorgewärmten Tiegelzange, bilden sich Schlieren und Trübungen; letztere lösen sich zuerst im unteren Bereich der Flüssigkeiten auf.
Morgen sehe ich mir das näher an
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo zusammen und herzlichen Dank für die weiteren Antworten!!!
Ich bin leider grad schwer anderweitig beschäftigt, werde mich aber so zeitnah wie möglich ausführlich melden und die Fragen beantworten.
Beste Grüße!
Nora
Guten Abend,
meinen oben beschriebenen Versuch habe ich zu Ende geführt. Er hat ergeben, dass beide von mir verwendete Paraffine sich jedenfalls nicht vollständig mit Iso mischen, wenn ich beide Stoffe im Volumenverhältnis von etwa 1 zu 1 ansetze, nicht bei 60 Grad und nicht bei 62 Grad. Es bildet sich vielmehr eine deutlich sichtbare Phasengrenze aus. Der über der Phasengrenze liegende Teil der Flüssigkeiten klärt sich zudem nach Schütteln nicht vollständig, sondern verbleibt auch nach über einer Stunde emulsionsartig, während der unterhalb der Phasengrenze liegende Teil völlig klar wird. Füge ich etwas Eosin hinzu, wird die Phasengrenze überaus deutlich.
Solange nicht geschüttelt oder gefärbt wird, fällt die Phasengrenze nicht schnell auf.
Wieviel Paraffin sich in Iso löst, kann ich nach meinem Versuch nicht sagen. Ich vermute aber, dass es nicht allzuviel sein kann. Die Phasengrenze teilt die Flüssigkeiten in etwa hälftig. Für einen Messversuch hätte ich das Volumen von Paraffin und Iso genau bestimmen müssen.
N-Butanol löst hingegen das Mercksche Paraffin von in etwa gleichem Volumen völlig klar. Auch Schütteln ergibt keinerlei Trübung.
Schöne Grüße
Jürgen
So, jetzt nochmal.
Also Danke für den Link und die Versuche, es scheint also daß es sich nicht nur bei mir trennt, und es vermutlich am Paraplast liegt?
Als ich gestern nachsah, war die Phasengrenze milchig verwaschen, durch Schütteln wurde alles trüb und so ist es immernoch.
Wenn ich es recht verstehe, sollte aber eigentlich eine klare Lösung entstehen? Ist Paraplast damit für die Isomethode unbrauchbar? Meins ist iü von Leica, falls das was zur Sache tut.
Die Temperatur des Wärmeschranks konnte ich noch nicht überprüfen, da unser Laborthermometer verschollen ist, aber wie ich lesen konnte, trat der Effekt auch bei 70°C noch auf.
@Klaus Henkel: Es freut mich den Autor persönlich lesen zu dürfen (ich wußte gar nicht daß Sie hier noch aktiv sind)! Die Frage bezieht sich auf Schritt F in Ihrer Ausführung. Schritt E hatte ich modifiziert und die Probe mit Iso4 auf 62° erwärmt (nachdem sie allerdings schon 2h auf 45° war), da das Paraplast das ich bin dahin auf einer Wärmeplatte stehn hatte noch nicht ganz geschmolzen war und ich sehn wollte ob das im Wärmeschrank schneller geht, ich habe leider nur einen. Da meine Arbeitszeit zuende war und meine Kinderlein zuhause warteten, habe ich die trübe Mischung in genannte Flasche gefüllt und im Wärmeschrank übernacht stehn lassen, wo ich am nächsten Tag eben die getrennten Phasen vorfand. Ich bin mittlerweile bei Schritt H (der sich nun auf 18h ausgedehnt hat...) und werd nun versuchen, ob mir Schritt I gelingt... Infiltriert dürfte es nach den langen Zeiten wohl sein. Mal sehn.
Falls es noch Ideen gibt, gerne. Ansonsten scheint mir, daß ich für mein Paraplast wohl den "normalen" Weg mit Rotihistol nehmen sollte.
Ich hab von meiner Vorgängerin allerdings noch einen unbeschrifteten Beutel mit weißen Pellets gefunden, ich vermute daß es sich hierbei um Paraffin handelt, da kuck ich mal ob sich das in Isoprop löst... Ich weiß halt nicht was für ein Paraffin es ist, vielleicht ists ja auch Paraplast ;D Naja, ich schau mal, mich würd halt interessieren wie es "richtig" aussieht, aber dafür muß ich mir vermutlich ein neues, definiertes Paraffin bestellen.
Ansonsten einfach nochmal Danke für die Hilfe!
Hallo,
@Jürgen
ZitatFür einen Messversuch hätte ich das Volumen von Paraffin und Iso genau bestimmen müssen.
Das hilft nichts um die Mischbarkeit zu bestimmen. Selbst wenn nachher beide Phasen jeweils 50% des Gesamtvolumens einnehmen, hat man eine Lösung von Paraffin in Isopropanol und eine Lösung von Isopropanol in Paraffin, die halt beide nicht miteinander mischbar sind.
Carsten
Hallo Carsten,
Danke für den Hinweis. Zusätzliche Maßnahmen wären erforderlich. Z.B. Absaugen einer Phase, Wiegen der verbleibenden Phase vor und nach Abdampfen des enthaltenen Isos?
Wie auch immer: Die Lösung von Paraffin in Iso funktioniert nur eingeschränkt und ich vermute, Dich als Chemiker wundert dies auch nicht. Als praktische Konsequenz wäre zu fragen, in welcher Phase der Iso / Paraffinstufe Herrn Henkels Körbchen hängt.
All dies soll natürlich nicht heißen, dass die Isomethode untauglich ist.
Liebe Nora,
Das von mir auch verwendete Mercksche Paraffin ist m.E. ohne Kunststoffanteile.
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Jürgen,
ZitatZusätzliche Maßnahmen wären erforderlich. Z.B. Absaugen einer Phase, Wiegen der verbleibenden Phase vor und nach Abdampfen des enthaltenen Isos?
Das wäre der experimentelle Weg. Man könnte aber auch in einem Fachbuch Physiaklische Chemie nachschlagen, wie das mit den Molvolumina war...
Aber dann könnte man auch in den tabellierten Löslichkeiten nachschlagen ;D
Carsten
Schnelles Zwischenupdate:
Ich habe das Unbekannte Paraffin geschmolzen und zimmerwarmes Iso dazugekippt (interessanter Effekt ;D), aber eine halbe Stunde später war alles eine wunderbare, einheitliche, glasklare Flüssigkeit. Bei gegebenen 62°. Daraus schließe ich, daß das Unbekannte kein Paraplast ist, und die schlechte Mischbarkeit wirklich am Paraplast liegt.
Nora,
hast Du Deine neue Flüssigkeit mit dem "unbekannten Paraffin" einmal geschüttelt? Siehst Du auch bei sorgfältigem Hinsehen keine Phasengrenze?
SChöne Grüße
Jürgen
Hallo,
wenn Ihr die nicht sehen könnt, nehmt doch mal einen Laserpointer. Unter Totalreflexion werden Ihr dann jede Phasengrenze erkennen.
Carsten
Gestern hab ich die neue Mischung wild geschwenkt (ich hab sie auf die Schnelle nur in ein Becherglas, da kriegt man das Paraffin besser raus), und sie blieb klar und Phasenlos. Heute konnte ich ebenfalls keine Phase erkennen, was vermutlich daran liegt daß keine Isoprop mehr drin war ;D. War kein Deckel drauf, es roch auch nicht mehr danach. Ich hab jetzt neues rein, muß nur noch warm werden. Wenn man zimmerwarmes Iso reinschüttet, kriegt man einen großen weißen amorphen Blob, da ist beim besten Willen keine Phase zu erkennen...
Laserpointer muß ich mal schaun ob wir haben.
Zitat von: Jürgen H. in Januar 15, 2015, 14:31:12 NACHMITTAGS
Wie auch immer: Die Lösung von Paraffin in Iso funktioniert nur eingeschränkt und ich vermute, Dich als Chemiker wundert dies auch nicht. Als praktische Konsequenz wäre zu fragen, in welcher Phase der Iso / Paraffinstufe Herrn Henkels Körbchen hängt.
All dies soll natürlich nicht heißen, dass die Isomethode untauglich ist.
Das von mir auch verwendete Mercksche Paraffin ist m.E. ohne Kunststoffanteile.
Jürgen
Guten Tag Jürgen H.
Das von mir beschriebene Verfahren wurde von Romeis in seiner 16. und Böck in der 17. Aufl, von Adam & Czihak, Krauter und Pfäfflin uneingeschränkt empfohlen. Da nimmt es nicht wunder, daß es seither nahezu ein halbes Jahrhundert in aller Welt von tausenden Anatomen und Histologen erfolgreich angewandt wird. Da ist es doch erfreulich, daß auch Sie der Methode attestieren, daß die hier diskutierten Mißerfolge ja nicht bedeuten müssen, daß sie untauglich sei. Naja, wer wollte da noch etwas anderes behaupten.
Ein "Mercksches Paraffin" ist mir leider nicht bekannt. Nennen Sie bitte den Markennamen und die ensprechende Variante unter der Merck es vertreibt. Daß es möglicherweise ohne "Kunststoffanteile" sei, kennzeichnen Sie zurecht mit "m.E.". Ich darf nochmals darauf hinweisen, daß für histologische Zwecke seit Jahrzehnten kein reines Paraffin mehr hergestellt wird, weil es für histologische Einbettungsverfahren ungeeignet ist. Deshalb hat man es ja früher künstlich durch Erhitzen "gealtert" und anschließend durch die Beimischung von Bienenwachs überhaupt erst schneidbar gemacht.
Zum Paraplast: Es gibt bestimmt ein halbes Dutzend verschiedene Paraplast-Sorten mit unterschiedlichen Eigenschaften, z. B. PARAPLAST medium, PARAPLAST® PLUS medium, PARAPLAST® X-TRA medium usw usw.
Welches wurde verwendet, wie alt war das? Wo und wie wurde es wie lange gelagert? War es schon einmal erhitzt worden, dann wäre es unbrauchbar für Einbettungen usw.
Hat der Iso Wasser gezogen? Dann gibts milchige Trübungen!
Grundsätzlich rate ich dazu, diese beiden Aufsätze langsam zu lesen und dann wörtlich zu befolgen. Zwar ist die Iso/Paraffin-Methode recht fehlertolerant, doch ist es auf alle Fälle besser sie strikt zu befolgen. Nur dann kann man Fehler erkennen und korrigieren.
http://www.klaus-henkel.de/isomethode.pdf
http://www.klaus-henkel.de/paraffin-intermedien.pdf
Viel Erfolg.
KH
Sehr verehrter Herr Henkel,
und das meine ich sehr ernst, weil Sie anderen und mir in Einigem mikroskopisch auf die Sprünge geholfen haben.
ZitatDa ist es doch erfreulich, daß auch Sie der Methode attestieren, daß die hier diskutierten Mißerfolge ja nicht bedeuten müssen, daß sie untauglich sei. Naja, wer wollte da noch etwas anderes behaupten.
Mit Ihrer leichten Ironie, die Sie hier leider für nötig halten, kann ich gut leben. Sie wissen ja in Wirklichkeit, dass ich mit meiner Bemerkung kein "Attest" ausstellen wollte, sondern nur einem immerhin denkbaren Missverständnis zuvor kommen wollte, ich würde entgegen der Literatur (Romeis, Henkel und andere) irgendeinen Unfug behaupten wollen.
Bei den von mir verwendeten Paraffin handelt es sich, wie ich oben erwähnte, um Mc. Cormick Paraplast plus und Merck Paraffin 56-58 in Pastillenform.
Ich füge hinzu: Merck Nr. 1.07337.1000 Mc. Cormick Nr. 39502004
Die Beschreibung des Merckschen Paraffins auf der Dose ergibt keinerlei Hinweise auf Kunststoffanteile, anders als das Paraffin von Mc. Cormick: " a compound of purified paraffin and plastic polymers..."
Die Paraffine sind selbstverständlich kühl, trocken und luftdicht verschlossen gelagert. Sie lösen sich ohne Phasengrenze und Trübungen in Xylol oder N-Butanol. Weiterhin ist mein Isopropanol ( Chroma 3D 085 ) über einem Molekularsieb aufbewahrt.
Ich sage nochmals: Die von mir beschriebenen Gemische lösen sich bei mir vollständig und klar, wenn ich sie bei Zimmertemperatur in ein Schnappsdeckelgläschen zueinander gebe und verschlossen im Wärmeschrank auf 62 Grad erwärme. Aber es bildet sich eine Phasengrenze aus. Diese ist kaum sichtbar, kann aber mit einem Laserpointer oder einer Taschenlampe gut sichtbar gemacht werden. Schütteln führt zu Schlieren und leichten Trübungen.
Haben Sie schon einmal Ihr Iso/Paraffingemisch auf die genannte Phasengrenze untersucht und können meine Beobachtung nicht bestätigen? Welches Paraffin verwenden Sie?
Schöne Grüße
Jürgen
Ich habe iü dieses Paraplast : http://www.carlroth.com/catalogue/catalogue.do;jsessionid=57D23BF20A94C055DB6F6EE956CA55ED?favOid=000000000003442000050023&act=showBookmark&lang=de-de&market=DE
also das linke im Bild. Die anderen beiden habe ich auch, aber noch nicht auf Mischbarkeit getestet, das versuch ich jetzt dann. Die Tüte stand hier etwa einen Monat verschlossen und unbenutzt herum bis ich mich ans Einbetten gewagt habe.
Isoprop habe ich das erwähnte frische Rotipuran p.a.
Trotz aller Trübung scheint das Einbetten iü gut funktioniert zu haben, ich habe Freitag noch den Block angeschnitten und war hellauf begeistert wie herrlich sich der scheiden ließ ;D ;D ;D Ich hatte bisher nur zu Übungszwecken alte Blöcke von meiner Vorgängerin abgearbeitet, und es war eigentlich jeder ein Ärgernis, teils bröselig, teils sind die Schnitte zu Streifen zerfallen, teils sind die Gewebe aus dem Paraffin gefallen usw. Der Paraplastblock dagegen schnitt sich sogar an der alten Klinge noch wie der Himmel, und das obwohl ich einen Schwamm mit Silikatnadeln darin hatte. Bin begeistert, und werde zukünftig entweder die Trübe bei der Iso/Paraplast mischung hinnehmen oder mal Rotihistol ausprobieren, aber auf jeden Fall erstmal beim Paraplast bleiben.
Schöne Grüße erstmal,
Nora
Zitat von: Jürgen H. in Januar 16, 2015, 20:48:19 NACHMITTAGS
[1] weil Sie anderen und mir in Einigem mikroskopisch auf die Sprünge geholfen haben.
[...]
[2] Haben Sie schon einmal Ihr Iso/Paraffingemisch auf die genannte Phasengrenze untersucht und können meine Beobachtung nicht bestätigen? Welches Paraffin verwenden Sie?
Schöne Grüße
Jürgen
zu 1: Danke. Es ist schön, wenn man solche Feedbacks bekommt.
zu 2: Ich habe verwendet: medite "tissuewax" Gewebeeinbettmedium für die Histologie. Pellet Form. Schmelzpunkt 56-58 °C.
von Medite Gesellschaft für Medizintechnik, Lehrter Straße 11, 3167 Burgdorf. Tel. 051 36 / 30 96.
Ein Freund hatte mir einen Restposten davon überlassen.
Keine Phasenbildung, saubere "Schmelze"; auch gute, klare Blöcke, gut schneidbar.
Grüße
KH
Vielen Dank für Ihre Rückmeldung, Herr Henkel. Anscheinend führen die unterschiedlichen Paraplaste bzgl. der vollständigen Lösung in Isopropanol zu unterschiedlichen Ergebnissen. Umso schöner, dass Nora trotz der bei ihrem Paraplast eingetretenen Trübungen zu guten Ergebnissen gekommen ist.
Ich selbst ziehe dem Iso N-Butanol oder das tertiäre Butanol als Intermedium, aufdas Sie ja auch hinweisen, bei weitem dem Iso vor. Bei Insekten funktioniert die Isomethode zwar auch prinzipiell, aber mit wesentlich schlechteren Ergebnissen als bei Verwendung eines Butanols. Das mag an den vielfachen gut abgeschotteten Hohlräumen (Tracheen, Luftsäcken) liegen, aber auch an der schnellen Flüchtigkeit des Isos. Ich habe mich daher vor einiger Zeit von der Isomethode vollständig abgewendet, zumal die Methode über Butanole, zumindest die über N-Butanol nicht komplizierter ist als die Isomethode. Bezüglich sonstiger histologischer Arbeiten habe ich keine Erfahrungswerte mit Iso.
Schöne Grüße
Jürgen
[ftp]
Zitat von: Jürgen H. in Januar 19, 2015, 12:32:27 NACHMITTAGS
[1] Anscheinend führen die unterschiedlichen Paraplaste bzgl. der vollständigen Lösung in Isopropanol zu unterschiedlichen Ergebnissen.
[2] Umso schöner, dass Nora trotz der bei ihrem Paraplast eingetretenen Trübungen zu guten Ergebnissen gekommen ist.
[3] Ich selbst ziehe dem Iso N-Butanol oder das tertiäre Butanol als Intermedium, auf das Sie ja auch hinweisen, bei weitem dem Iso vor. Bei Insekten funktioniert die Isomethode zwar auch prinzipiell, aber mit wesentlich schlechteren Ergebnissen als bei Verwendung eines Butanols. Das mag an den vielfachen gut abgeschotteten Hohlräumen (Tracheen, Luftsäcken) liegen, aber auch an der schnellen Flüchtigkeit des Isos. Ich habe mich daher vor einiger Zeit von der Isomethode vollständig abgewendet, zumal die Methode über Butanole, zumindest die über N-Butanol nicht komplizierter ist als die Isomethode. Bezüglich sonstiger histologischer Arbeiten habe ich keine Erfahrungswerte mit Iso.
Jürgen
Zu 1: Ich verdächtige eher unterschiedliche Handhabung beim Umgang mit den kalten und erwärmten Ingredienzen. Die Verarbeitungseigenschaften der verschiedenen Paraffin-Mischungen sollte zu denselben Ergebnissen führen, sonst wären sie in der Medizntechnik nicht austauschbar und damit unbrauchbar. Ich habe da so meine Idealvorstellungen.
Aber auch gegen das verwendete Isopropanol habe ich Bedenken. Auch wenn Fa. Roth es unter der Markenbezeichnung Rotipuran mit >/= 99,7% "p.a." verkauft. Aber 99,7 ist eben
nicht völlig wasserfrei. Wasserfreier Isopropylalkohol wird mit der Bezeichnung n-Propanol 100% verkauft. Wenn der Alk. nicht völlig (!) wasserfrei ist, sind Trübungen die unvermeidliche Folge!
Zu 2: Ja, habe mich beim Lesen auch gefreut.
Zu 3: Butanol ist auf jeden Fall (noch!) zuverlässiger als Iso, ganz klar. Und nein, die Methode ist nicht umständlicher als die Iso-Methode. Der Vorteil der Isomethode liegt ja doch darin, daß sie bei den meisten Präparaten sehr gut funtioniert und man dann
kein weiteres Lösungsmittel im gesamten Prozeß braucht als eben Iso 100%. Das ist und die Fehlertoleranz sind die entscheidenden Vorteile.
Ich füge spaßeshalber noch drei "Rezeptblätter" Methodenbeschreibung für die Insektenpräparation bei, die ich in meinem ererbten Expl. von Seiferts Entomolog. Praktikum gefunden habe.
Grüße
KH
http://www.klaus-henkel.de/insektpraep1.jpg
http://www.klaus-henkel.de/insektpraep2.jpg
Lieber Herr Henkel,
herzlichen Dank für das Einstellen der beiden Rezepturen zum Einbetten von ganzen Insekten oder insektenteilen, die sich in Ihrem Seifert fanden! Und da Sie Seiferts Entomologisches Praktikum ansprechen: Ich habe mich immer gewundert, warum dort im Anhang zwar Fixiermethoden und Färbungen angegeben sind, nicht aber Vorschriften für das Entwässern und Einbetten. Wie bei diesen beiden letztgenannten Punkten zu verfahren ist, war Herrn Seifert anscheinend selbstverständlich. Ich hätte allerdings gerne gewusst, welche Methoden er angewendet hat; dies hatte mir vermutlich so manchen untauglichen Versuch erspart.
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Nora
Ich gehe anders vor ...
*) Das Material wird von der Archivlösung in Alkoholstufen ins reine ISO überführt und ISO 3 x gewechselt
Im 3. Teil bleibt das Material ja nach Größe für eine bis 24 Stunden (alles im Sterilisator bei 65 Grad)
*) Dort gebe ich Paraplast dazu, dieses treibt anfänglich an der Oberfläche und löst sich aber schnell auf. Ich starte nach Gefühl ==> Ziel ist eine ca. 10%ige Lösung, ich rühre immer wieder um ...
*) ich erhöhe schrittweise und komme so nach 1 bis 3 Tagen zu einer reinen Parplastlösung (ISO ist vollständig verdunstet, immer noch dünnflüssig)
*) dann in die gekühlte Form (ALU-Trögchen) umfüllen und ab in den Eiskasten
*) Alufolie ablösunen, aufschmelzen, zurichten und schneiden ...
:-) fertig, so habe ich etliche hundert Blöckchen in den Größen 10 x 10 x 10 mm bis zu 45 x 45 x15 mm ohne Probleme gefertigt ...
Liebe Grüße aus Wien
Gerhard
Hallo Herr Henkel,
Zitat von: Klaus Henkel in Januar 19, 2015, 16:12:59 NACHMITTAGS
Wasserfreier Isopropylalkohol wird mit der Bezeichnung n-Propanol 100% verkauft.
nur der Vollständigkeit halber: n-Propanol ist kein Isopropanol.
Mit herzlichen Grüßen
Timm
Zitat von: treinisch in Januar 21, 2015, 01:40:00 VORMITTAG
Hallo Herr Henkel,
Zitat von: Klaus Henkel in Januar 19, 2015, 16:12:59 NACHMITTAGS
Wasserfreier Isopropylalkohol wird mit der Bezeichnung n-Propanol 100% verkauft.
nur der Vollständigkeit halber: n-Propanol ist kein Isopropanol.
Mit herzlichen Grüßen
Timm
Ja. Aber die Tasten n und 2 liegen auf meiner Tastatur so eng bei ein an der!
Gruß
KH
Hallo Gerhard,
"*) dann in die gekühlte Form (ALU-Trögchen) umfüllen und ab in den Eiskasten"
Bei der Methode und den genannten Abmessungen gibt's bei mir immer einen ausgeprägten Paraffinnabel, weil es außen blitzschnell erkaltet und innen schrumpft. Wie umgeht man das?
Gruß
Horst
Zitat von: Horst Wörmann in Januar 21, 2015, 10:38:32 VORMITTAG
Hallo Gerhard,
"*) dann in die gekühlte Form (ALU-Trögchen) umfüllen und ab in den Eiskasten"
Bei der Methode und den genannten Abmessungen gibt's bei mir immer einen ausgeprägten Paraffinnabel, weil es außen blitzschnell erkaltet und innen schrumpft. Wie umgeht man das?
Gruß
Horst
Lieber Herr Wörmann!
Das ist auf Seite 7 f. ausführlichst diskutiert: http://www.klaus-henkel.de/isomethode.pdf
Gruß
KH
Hallo Horst
Ich umgehe das indem ich viel Paraplast drumherum habe, das wird beim zurichten des Blockes weggeschnitten. Auf den ersten 1 bis 2 mm habe ich .... Aber dort ist kein zu schneidendes Material.
Ich tropfe in die Mitte des Troegchens fluessiges Paraplast, wenn das beginnt leicht fest zu werden stecke ich das Objeckt und fuelle schnell auf. Nur oben und auf den Seiten habe ich habe ich leichtes Einziehen, das ist aber im Kernbereich nicht wirksam ...
Liebe Gruesse
Gerhard
So, jetzt muss ich die Seite 7 lesen, bin gespannt ...
Ich hab noch was vergessen ...
Es gibt da noch einen kleinen Trick um das Paraplast besser schneidbar zo machen ==> ca. 15% biologisches Bienenwachs beimengen ...
Der Oelersatz .-)
Gibt super Schneidebaender wenn mit dem B-Messer geschnitten wird ...
Liebe Gruesse
Gerhard
ZitatEs gibt da noch einen kleinen Trick um das Paraplast besser schneidbar zo machen ==> ca. 15% biologisches Bienenwachs beimengen ...
NOCH besser schneidbar?!?! :o
das Rotipuran hat nach Angabe einen Wassergehalt <0,05%. Wenn sich das "normale" Paraffin damit trüben würde, würd ich ja sagen, OK, das ist noch zuviel, aber die Phasen und die Trübung entstehen NUR beim Paraplast und nicht beim Paraffin, für mich folgt damit logisch, daß das Paraplast und nicht das Restwasser im Isoprop "schuld" ist. Ich hab jetzt das Paraplast mit DMSO ausprobiert, es wird ebenfalls trüb, auch wenn ich mir einbilde, etwas weniger.
Ich werde weiterexperimentieren, gestern habe ich etliche neue Gewebestückchen fixiert und harre nun, daß das Zeug ausgewaschen ist und entwässert werden kann. Es scheint ja grundsätzlich auch mit der trüben "Lösung" zu funktionieren. Die Methode von Gerhard (Danke dafür!!) werde ich ich parallel ausprobieren, eine recht ähnliche erreichte mich per email (auch hierfür schonmal herzlichen Dank!), und evtl probier ich doch auch den Rotihistolweg. Vielleicht schau ich mal auch, ob ich noch ein anderes Paraplast auftreibe.
Es gibt also viel zu tun. ;D
Viele Grüße,
Nora
Zwischenupdate: Habe meine Proben am Freitag noch entwässert und ein paar Mal das Isoprop gewechselt, dann frisches Iso in Blaudeckelglasflasche, Stückchen rein, mit Paraplastpellets aufgefüllt und in den Wärmeschrank. Ein paar mal hab ich noch geschwenkt, da war aber alles noch weit von "geschmolzen" entfernt. Deckel drauf aber nicht ganz zu, aber augenscheinlich trotzdem zu fest, ich hatte gehofft das Iso verdunstet übers Wochenende. Nunja, heut früh sah alles klar aus, hab mich schon gefreut ;D, aber ein kurzes Schwenken erbrachte wieder eine trübe Suppe... Naja, jetzt ist der Deckel ganz offen, und ich hoffe daß es schnell abdampft. Ob ich dann nochmal in frisches Paraplast gehe muß ich überlegen, heut wird das Verdunsten sicher eh nichts mehr. Mal sehn, ich bin weiterhin gespannt.
So, nach zwei Jahren hier auch mal noch ein Update...
Ich hab vor ein paar Monaten wieder mit dem Paraplasteinbetten angefangen, und dabei noch eine interessante Entdeckung gemacht, die zwar wahrscheinlich nur ich spannend finde, aber vielleicht doch auch noch jemand anderer. Und zwar gehe ich immoment folgendermaßen vor: Entwässerte Probe kommt in frischem Isoprop in den Wärmeschrank und steht da etwa 2h, damit es auch wirklich 62° hat. Dann gebe ich mit der Pipette immer mal wieder ein Schlückchen Paraplast hinzu, schwenke, es wird trüb. Ursprünglich soviel Paraplast, daß es etwa 1:1 Paraplast und Isoprop am Ende sind. Nun war ich gelegentlich überschwenglich und hab auch nicht genau geschaut wieviel Iso nun im Gefäß war, und schwupp, einmal ist beim Schwenken die trübe Lösung plötzlich klar geworden? Und: Sie trennt sich auch nicht mehr! Wenn man schwenkt sieht man höchstens am Anfang noch ein paar Schlieren von der Probe abgehen (Isoprop aus dem Gewebe wahrscheinlich), aber die Mischung ist und bleibt klar! Und zwar wie ich mittlerweile getestet habe, etwa bei Paraplast zu Isoprop 2:1. Seither fülle ich dann immer auf eben 2:1 statt nur bis 1:1 auf und lasse die Mischung dann über nacht abdampfen. Es ist immerwieder ein Erlebnis, wie die milchige Suppe wenn man an die 2:1 kommt beim Schwenken plötzlich wie von Geisterhand klar wird.
Beim Schneiden und färben merke ich im übrigen keinerleich Unterschiede zu vorher, aber irgendwie ist es psychologisch angenehmer wenn man wirklich eine klare Lösung hat und nicht diese trübe Mischung. 8)
In diesem Sinne!
Nora
Zitat von: Nora in Januar 20, 2017, 11:34:11 VORMITTAG
So, nach zwei Jahren hier auch mal noch ein Update...
Ich hab vor ein paar Monaten wieder mit dem Paraplasteinbetten angefangen, und dabei noch eine interessante Entdeckung gemacht, die zwar wahrscheinlich nur ich spannend finde, aber vielleicht doch auch noch jemand anderer. Und zwar gehe ich immoment folgendermaßen vor: Entwässerte Probe kommt in frischem Isoprop in den Wärmeschrank und steht da etwa 2h, damit es auch wirklich 62° hat. Dann gebe ich mit der Pipette immer mal wieder ein Schlückchen Paraplast hinzu, schwenke, es wird trüb. Ursprünglich soviel Paraplast, daß es etwa 1:1 Paraplast und Isoprop am Ende sind. Nun war ich gelegentlich überschwenglich und hab auch nicht genau geschaut wieviel Iso nun im Gefäß war, und schwupp, einmal ist beim Schwenken die trübe Lösung plötzlich klar geworden? Und: Sie trennt sich auch nicht mehr! Wenn man schwenkt sieht man höchstens am Anfang noch ein paar Schlieren von der Probe abgehen (Isoprop aus dem Gewebe wahrscheinlich), aber die Mischung ist und bleibt klar! Und zwar wie ich mittlerweile getestet habe, etwa bei Paraplast zu Isoprop 2:1. Seither fülle ich dann immer auf eben 2:1 statt nur bis 1:1 auf und lasse die Mischung dann über nacht abdampfen. Es ist immerwieder ein Erlebnis, wie die milchige Suppe wenn man an die 2:1 kommt beim Schwenken plötzlich wie von Geisterhand klar wird.
Beim Schneiden und färben merke ich im übrigen keinerleich Unterschiede zu vorher, aber irgendwie ist es psychologisch angenehmer wenn man wirklich eine klare Lösung hat und nicht diese trübe Mischung. 8)
In diesem Sinne!
Nora
Guten Tag Nora und gutes neues Jahr!
Ja 1:1 oder 2:1 ?? Was ist ,,richtig"?
Dazu eine kleine Geschichte.
Dieter Gerlach schreibt in seinem Buch
Botanische Mikrotechnik Gg. Thieme, Stuttgart 1977) für verschiedene Färbungen unvergällten Äthylalkohol vor. So etwas kann schon sein.
Ich rief ihn an. Seine Antwort: Ach ja, ich könne auch vergällten nehmen. Als ein Kollege in der Uni Erlangen in Pension ging, habe ihm der einen großen Glasballon voll unvergällten Alkohols hinterlassen. Den habe er (Gerlach) dann für seine Färbeversuche verwendet und im Laborbuch genau protokolliert, mit welchen Stoffen seine Versuche erfolgreich waren. Aus diesen Aufzeichnungen sei dann schließlich sein Buch entstanden. Darin müsse doch stehen, welches Material er tatsächlich erfolgreich verwendet habe – und nicht was er mit gleichem Erfolg ebenso gut hätte verwenden können.
Alles ist eben relativ ...
Beste Grüße!
KH