Frage zur Isomethode nach Klaus Henkel

[Jürgen H.]

Nora,

hast Du Deine neue Flüssigkeit mit dem "unbekannten Paraffin" einmal geschüttelt? Siehst Du auch bei sorgfältigem Hinsehen keine Phasengrenze?

SChöne Grüße

Jürgen

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
wenn Ihr die nicht sehen könnt, nehmt doch mal einen Laserpointer. Unter Totalreflexion werden Ihr dann jede Phasengrenze erkennen.
Carsten

[Nora]

Gestern hab ich die neue Mischung wild geschwenkt (ich hab sie auf die Schnelle nur in ein Becherglas, da kriegt man das Paraffin besser raus), und sie blieb klar und Phasenlos. Heute konnte ich ebenfalls keine Phase erkennen, was vermutlich daran liegt daß keine Isoprop mehr drin war  . War kein Deckel drauf, es roch auch nicht mehr danach. Ich hab jetzt neues rein, muß nur noch warm werden. Wenn man zimmerwarmes Iso reinschüttet, kriegt man einen großen weißen amorphen Blob, da ist beim besten Willen keine Phase zu erkennen...
Laserpointer muß ich mal schaun ob wir haben.

[Klaus Henkel]

Wie auch immer: Die Lösung von Paraffin in Iso funktioniert nur eingeschränkt und ich vermute, Dich als Chemiker wundert dies auch nicht.  Als praktische Konsequenz wäre zu fragen, in welcher Phase der Iso / Paraffinstufe Herrn Henkels Körbchen hängt.

All dies soll natürlich nicht heißen, dass die Isomethode untauglich ist.

Das von mir auch verwendete Mercksche Paraffin ist m.E. ohne Kunststoffanteile.

Jürgen

Guten Tag Jürgen H.

Das von mir beschriebene Verfahren wurde von Romeis in seiner 16. und Böck in der 17. Aufl, von Adam & Czihak, Krauter und Pfäfflin uneingeschränkt empfohlen. Da nimmt es nicht wunder, daß es seither nahezu ein halbes Jahrhundert in aller Welt von tausenden Anatomen und Histologen erfolgreich angewandt wird. Da ist es doch erfreulich, daß auch Sie der Methode attestieren, daß die hier diskutierten Mißerfolge ja nicht bedeuten müssen, daß sie untauglich sei. Naja, wer wollte da noch etwas anderes behaupten.

Ein "Mercksches Paraffin" ist mir leider nicht bekannt. Nennen Sie bitte den Markennamen und die ensprechende Variante unter der Merck es vertreibt. Daß es möglicherweise ohne "Kunststoffanteile" sei, kennzeichnen Sie zurecht mit "m.E.". Ich darf nochmals darauf hinweisen, daß für histologische Zwecke seit Jahrzehnten kein reines Paraffin mehr hergestellt wird, weil es für histologische Einbettungsverfahren ungeeignet ist. Deshalb hat man es ja früher künstlich durch Erhitzen "gealtert" und anschließend durch die Beimischung von Bienenwachs überhaupt erst schneidbar gemacht.

Zum Paraplast: Es gibt bestimmt ein halbes Dutzend verschiedene Paraplast-Sorten mit unterschiedlichen Eigenschaften, z. B. PARAPLAST medium, PARAPLAST® PLUS medium, PARAPLAST® X-TRA medium usw usw.

Welches wurde verwendet, wie alt war das? Wo und wie wurde es wie lange gelagert? War es schon einmal erhitzt worden, dann wäre es unbrauchbar für Einbettungen usw.
Hat der Iso Wasser gezogen? Dann gibts milchige Trübungen!

Grundsätzlich rate ich dazu, diese beiden Aufsätze langsam zu lesen und dann wörtlich zu befolgen. Zwar ist die Iso/Paraffin-Methode recht fehlertolerant, doch ist es auf alle Fälle besser sie strikt zu befolgen. Nur dann kann man Fehler erkennen und korrigieren.

http://www.klaus-henkel.de/isomethode.pdf

http://www.klaus-henkel.de/paraffin-intermedien.pdf

Viel Erfolg.

KH

[Jürgen H.]

Sehr verehrter Herr Henkel,

und das meine ich sehr ernst, weil Sie anderen und mir in Einigem mikroskopisch auf die Sprünge geholfen haben.

Da ist es doch erfreulich, daß auch Sie der Methode attestieren, daß die hier diskutierten Mißerfolge ja nicht bedeuten müssen, daß sie untauglich sei. Naja, wer wollte da noch etwas anderes behaupten.

Mit Ihrer leichten Ironie, die Sie hier leider für nötig halten, kann ich gut leben. Sie wissen ja in Wirklichkeit, dass ich mit meiner Bemerkung kein "Attest" ausstellen wollte, sondern nur einem immerhin denkbaren Missverständnis zuvor kommen wollte, ich würde entgegen der  Literatur (Romeis, Henkel und andere) irgendeinen Unfug behaupten wollen.

Bei den von mir verwendeten Paraffin handelt es sich, wie ich oben erwähnte, um Mc. Cormick Paraplast plus und Merck Paraffin 56-58 in Pastillenform.

Ich füge hinzu: Merck Nr. 1.07337.1000 Mc. Cormick  Nr. 39502004

Die Beschreibung des Merckschen Paraffins auf der Dose ergibt keinerlei Hinweise auf Kunststoffanteile, anders als das Paraffin von Mc. Cormick: " a compound of purified paraffin and plastic polymers..."

Die Paraffine sind selbstverständlich kühl, trocken und luftdicht verschlossen gelagert. Sie lösen sich ohne Phasengrenze und Trübungen in Xylol oder N-Butanol. Weiterhin ist mein Isopropanol ( Chroma 3D 085 ) über einem Molekularsieb aufbewahrt.

Ich sage nochmals: Die von mir beschriebenen Gemische lösen sich bei mir vollständig und klar, wenn ich sie bei Zimmertemperatur in ein Schnappsdeckelgläschen zueinander gebe und verschlossen im Wärmeschrank auf 62 Grad erwärme. Aber es bildet sich eine Phasengrenze aus. Diese ist kaum sichtbar, kann aber mit einem Laserpointer oder einer   Taschenlampe  gut sichtbar gemacht werden. Schütteln führt zu  Schlieren und leichten Trübungen.

Haben Sie schon einmal Ihr Iso/Paraffingemisch auf die genannte Phasengrenze untersucht und können meine Beobachtung nicht bestätigen? Welches Paraffin verwenden Sie?

Schöne Grüße

Jürgen

[Nora]

Ich habe iü dieses Paraplast : http://www.carlroth.com/catalogue/catalogue.do;jsessionid=57D23BF20A94C055DB6F6EE956CA55ED?favOid=000000000003442000050023&act=showBookmark&lang=de-de&market=DE
also das linke im Bild. Die anderen beiden habe ich auch, aber noch nicht auf Mischbarkeit getestet, das versuch ich jetzt dann. Die Tüte stand hier etwa einen Monat verschlossen und unbenutzt herum bis ich mich ans Einbetten gewagt habe.
Isoprop habe ich das erwähnte frische Rotipuran p.a.

Trotz aller Trübung scheint das Einbetten iü gut funktioniert zu haben, ich habe Freitag noch den Block angeschnitten und war hellauf begeistert wie herrlich sich der scheiden ließ  Ich hatte bisher nur zu Übungszwecken alte Blöcke von meiner Vorgängerin abgearbeitet, und es war eigentlich jeder ein Ärgernis, teils bröselig, teils sind die Schnitte zu Streifen zerfallen, teils sind die Gewebe aus dem Paraffin gefallen usw. Der Paraplastblock dagegen schnitt sich sogar an der alten Klinge noch wie der Himmel, und das obwohl ich einen Schwamm mit Silikatnadeln darin hatte. Bin begeistert, und werde zukünftig entweder die Trübe bei der Iso/Paraplast mischung hinnehmen oder mal Rotihistol ausprobieren, aber auf jeden Fall erstmal beim Paraplast bleiben.

Schöne Grüße erstmal,

Nora

[Klaus Henkel]

[1] weil Sie anderen und mir in Einigem mikroskopisch auf die Sprünge geholfen haben.
[...]

[2] Haben Sie schon einmal Ihr Iso/Paraffingemisch auf die genannte Phasengrenze untersucht und können meine Beobachtung nicht bestätigen? Welches Paraffin verwenden Sie?

Schöne Grüße
Jürgen

zu 1:  Danke. Es ist schön, wenn man solche Feedbacks bekommt.

zu 2: Ich habe verwendet: medite "tissuewax" Gewebeeinbettmedium für die Histologie. Pellet Form. Schmelzpunkt 56-58 °C.
von Medite Gesellschaft für Medizintechnik, Lehrter Straße 11, 3167 Burgdorf. Tel. 051 36 /  30 96.
Ein Freund hatte mir einen Restposten davon überlassen.

Keine Phasenbildung, saubere "Schmelze"; auch gute, klare Blöcke, gut schneidbar.

Grüße
KH

[Jürgen H.]

Vielen Dank für Ihre Rückmeldung, Herr Henkel. Anscheinend führen die unterschiedlichen Paraplaste bzgl. der vollständigen Lösung in Isopropanol zu unterschiedlichen Ergebnissen. Umso schöner, dass Nora trotz der bei ihrem Paraplast eingetretenen Trübungen zu guten Ergebnissen gekommen ist.

Ich selbst  ziehe dem Iso N-Butanol oder das tertiäre Butanol als Intermedium, aufdas Sie ja auch hinweisen, bei weitem dem Iso vor. Bei Insekten funktioniert die Isomethode zwar auch prinzipiell, aber mit wesentlich schlechteren Ergebnissen als bei Verwendung eines Butanols. Das mag an den vielfachen gut abgeschotteten Hohlräumen (Tracheen, Luftsäcken) liegen, aber auch an der schnellen Flüchtigkeit des Isos. Ich habe mich daher vor einiger Zeit von der Isomethode vollständig abgewendet, zumal die Methode über Butanole, zumindest die über N-Butanol nicht komplizierter ist als die Isomethode. Bezüglich sonstiger histologischer Arbeiten habe ich keine Erfahrungswerte mit Iso.

Schöne Grüße

Jürgen

[Klaus Henkel]

[ftp]

[1]  Anscheinend führen die unterschiedlichen Paraplaste bzgl. der vollständigen Lösung in Isopropanol zu unterschiedlichen Ergebnissen.


  [2]  Umso schöner, dass Nora trotz der bei ihrem Paraplast eingetretenen Trübungen zu guten Ergebnissen gekommen ist.

  [3]  Ich selbst  ziehe dem Iso N-Butanol oder das tertiäre Butanol als Intermedium, auf das Sie ja auch hinweisen, bei weitem dem Iso vor. Bei Insekten funktioniert die Isomethode zwar auch prinzipiell, aber mit wesentlich schlechteren Ergebnissen als bei Verwendung eines Butanols. Das mag an den vielfachen gut abgeschotteten Hohlräumen (Tracheen, Luftsäcken) liegen, aber auch an der schnellen Flüchtigkeit des Isos. Ich habe mich daher vor einiger Zeit von der Isomethode vollständig abgewendet, zumal die Methode über Butanole, zumindest die über N-Butanol nicht komplizierter ist als die Isomethode. Bezüglich sonstiger histologischer Arbeiten habe ich keine Erfahrungswerte mit Iso.
Jürgen

Zu 1:  Ich verdächtige eher unterschiedliche Handhabung beim Umgang mit den kalten und erwärmten Ingredienzen. Die Verarbeitungseigenschaften der verschiedenen Paraffin-Mischungen sollte zu denselben Ergebnissen führen, sonst wären sie in der Medizntechnik nicht austauschbar und damit unbrauchbar. Ich habe da so meine Idealvorstellungen.
Aber auch gegen das verwendete Isopropanol habe ich Bedenken. Auch wenn Fa. Roth es unter der Markenbezeichnung Rotipuran mit >/= 99,7% "p.a." verkauft. Aber 99,7 ist eben nicht völlig wasserfrei. Wasserfreier Isopropylalkohol wird mit der Bezeichnung n-Propanol 100% verkauft. Wenn der Alk. nicht völlig (!) wasserfrei ist, sind Trübungen die unvermeidliche Folge!

Zu 2:  Ja, habe mich beim Lesen auch gefreut.

Zu 3:  Butanol ist auf jeden Fall (noch!) zuverlässiger als Iso, ganz klar. Und nein, die Methode ist nicht umständlicher als die Iso-Methode. Der Vorteil der Isomethode liegt ja doch darin, daß sie bei den meisten Präparaten sehr gut funtioniert und man dann kein weiteres Lösungsmittel im gesamten Prozeß braucht als eben Iso 100%. Das ist und die Fehlertoleranz sind die entscheidenden Vorteile.


Ich füge spaßeshalber noch drei "Rezeptblätter" Methodenbeschreibung für die Insektenpräparation bei, die ich in meinem ererbten Expl. von Seiferts Entomolog. Praktikum gefunden habe.

Grüße
KH

http://www.klaus-henkel.de/insektpraep1.jpg
http://www.klaus-henkel.de/insektpraep2.jpg

[Jürgen H.]

Lieber Herr Henkel,

herzlichen Dank für das Einstellen der beiden Rezepturen zum Einbetten von ganzen Insekten oder insektenteilen, die sich in Ihrem Seifert fanden! Und da Sie Seiferts Entomologisches Praktikum ansprechen: Ich habe mich immer gewundert, warum dort im Anhang zwar Fixiermethoden und Färbungen angegeben sind, nicht aber Vorschriften für das Entwässern und Einbetten. Wie bei diesen beiden letztgenannten Punkten zu verfahren ist, war Herrn Seifert anscheinend selbstverständlich. Ich hätte allerdings gerne gewusst, welche Methoden er angewendet hat; dies hatte mir vermutlich so manchen untauglichen Versuch erspart.

Schöne Grüße

Jürgen

[Rawfoto]

Hallo Nora

Ich gehe anders vor ...

*) Das Material wird von der Archivlösung in Alkoholstufen ins reine ISO überführt und ISO 3 x gewechselt
Im 3. Teil bleibt das Material ja nach Größe für eine bis 24 Stunden (alles im Sterilisator bei 65 Grad)
*) Dort gebe ich Paraplast dazu, dieses treibt anfänglich an der Oberfläche und löst sich aber schnell auf. Ich starte nach Gefühl ==> Ziel ist eine ca. 10%ige Lösung, ich rühre immer wieder um ...
*) ich erhöhe schrittweise und komme so nach 1 bis 3 Tagen zu einer reinen Parplastlösung (ISO ist vollständig verdunstet, immer noch dünnflüssig)
*) dann in die gekühlte Form (ALU-Trögchen) umfüllen und ab in den Eiskasten
*) Alufolie ablösunen, aufschmelzen, zurichten und schneiden ...

:-) fertig, so habe ich etliche hundert Blöckchen in den Größen 10 x 10 x 10 mm bis zu 45 x 45 x15 mm ohne Probleme gefertigt ...

Liebe Grüße aus Wien

Gerhard

[treinisch]

Hallo Herr Henkel,

Wasserfreier Isopropylalkohol wird mit der Bezeichnung n-Propanol 100% verkauft.

nur der Vollständigkeit halber: n-Propanol ist kein Isopropanol.

Mit herzlichen Grüßen

Timm

[Klaus Henkel]

Hallo Herr Henkel,

Wasserfreier Isopropylalkohol wird mit der Bezeichnung n-Propanol 100% verkauft.

nur der Vollständigkeit halber: n-Propanol ist kein Isopropanol.
Mit herzlichen Grüßen
Timm

Ja. Aber die Tasten n und 2 liegen auf meiner Tastatur so eng bei ein an der!
Gruß
KH

[Horst Wörmann]

Hallo Gerhard,

"*) dann in die gekühlte Form (ALU-Trögchen) umfüllen und ab in den Eiskasten"
Bei der Methode und den genannten Abmessungen gibt's bei mir immer einen ausgeprägten Paraffinnabel, weil es außen blitzschnell erkaltet und innen schrumpft. Wie umgeht man das?
Gruß
Horst

[Klaus Henkel]

Hallo Gerhard,

"*) dann in die gekühlte Form (ALU-Trögchen) umfüllen und ab in den Eiskasten"
Bei der Methode und den genannten Abmessungen gibt's bei mir immer einen ausgeprägten Paraffinnabel, weil es außen blitzschnell erkaltet und innen schrumpft. Wie umgeht man das?
Gruß
Horst

Lieber Herr Wörmann!
Das ist auf Seite 7 f. ausführlichst diskutiert: http://www.klaus-henkel.de/isomethode.pdf
Gruß
KH