Hallo in die Runde
Ich habe in der letzten Zeit versucht, Gastrotrichen mit Hamalaun zu färben. Obwohl andere Färbungen (Methylgrün, Methylenblau, Eosin) problemlos geklappt haben, ist die H&E-Übersichtsfärbung vollständig misslungen. Das Hämaleun lässt sich bei den Totalpräparaten (warum auch immer) nicht "bläuen" und ergibt bestenfalls einen diffusen Hintergrund.
Deshalb bin ich auf der Suche nach einer anderen Übersichtsfärbung. In der Literatur wird Boraxkarmin empfohlen. Gleichzeitig lese ich aber, das diese Färbung bei Formol-Fixierung sehr schlecht ausfällt. Deshalb meine Fragen:
- Hat jemand Erfahrung mit Boraxkarmin nach einer Fixierung mit Formol?
- Ist Boraxkarmin für Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden geeignet?
- Kennt jemand eine andere Übersichtsfärbung für Totalpräparate von Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden nach Formol-Fixierung?
Ich bin für jede Idee dankbar.
Freundliche Grüsse,
Michael
Zitat von: Michael in Oktober 08, 2015, 10:25:18 VORMITTAG
...
Ich habe in der letzten Zeit versucht, Gastrotrichen mit Hamalaun zu färben. Obwohl andere Färbungen (Methylgrün, Methylenblau, Eosin) problemlos geklappt haben, ist die H&E-Übersichtsfärbung vollständig misslungen. Das Hämaleun lässt sich bei den Totalpräparaten (warum auch immer) nicht "bläuen" und ergibt bestenfalls einen diffusen Hintergrund.
Deshalb bin ich auf der Suche nach einer anderen Übersichtsfärbung. In der Literatur wird Boraxkarmin empfohlen. Gleichzeitig lese ich aber, das diese Färbung bei Formol-Fixierung sehr schlecht ausfällt. Deshalb meine Fragen:
- Hat jemand Erfahrung mit Boraxkarmin nach einer Fixierung mit Formol?
- Ist Boraxkarmin für Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden geeignet?
- Kennt jemand eine andere Übersichtsfärbung für Totalpräparate von Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden nach Formol-Fixierung?
Ich bin für jede Idee dankbar.
...
Michael
Guten Tag Michael!
Um feststellen oder wenigstens vermuten zu können, ob und welche Verarbeitungsfehler vorliegen, muß man sehr präzise und ausfühlrlich darlegen, wie Sie gearbeitet haben, welche Färbevorschriften Sie befolgt haben und wo sie veröffentlicht sind: Verfasser, Titel, Auflage, Seite. Erst dann ist nachvollziehbar, wie Sie vorgegangen sind.
Ohne diese Angaben, müssen Sie abwarten, ob jemand einen genialen Geistesblitz hat. Ich selbst glaube lieber an exakte Angaben als an Geistesblitze.
Sie sind wieder am Zug!
Grüße
KH
Hallo Hr. Henkel,
vielen Dank für Ihre Antwort.
Mein erster Gedanke war auch, dass ich bei der Hämalaun-Färbung (nach Mayer) irgend etwas falsch gemacht habe. Ich habe eine käufliche Lösung verwendet und nach dem Standard-Färbeprotokoll gearbeitet (5min Hämalaun, Auswaschen, 15 min Bläuen in leicht alkalischem Leitungswasser).
Um meine Vorgehensweise und die Qualität der Färbelösung zu überprüfen, habe ich zur Kontrolle in dem gleichen Färbegang einige Algen mitgefärbt. Die Färbeergebnisse bei den Algen waren OK - kontrastreiche und scharfe Kernfärbung. Bei den Gastrotrichen hatte ich lediglich einen schwachen, rotvioletten Hintergrund im Gewebe.
Daraus schließe ich, dass:
- das Färbeprotokoll in Ordnung war
- die verwendeten Reagenzien brauchbar waren
- das Hämalaun in den Gastrotrichen eingedrungen ist
- das Hämalaun im Gastrotrichen durch das leicht alkalische Leitungswasser nicht gebläut wurde
Woran das liegt weis ich nicht - vielleicht ist der pH-Wert des Gewebes zu klein, um durch das Wasser über die "Bläuungsschwelle" gehoben zu werden?
Meine Frage ist also, ob es noch andere, empfehlenswerte Übersichtfärbungen gibt?
Grüße,
Michael Müller
Michael,
Ich weis zwar nicht was Gastrotrichen sind aber wenn es Tierliches Gewebe ist Farbe ich sehr gerne mit die Trichrom nach Frank Burr Mallory.
Einfach durch zu fuhren und gelingt auch an Formol Fixiertes Gewebe.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/179661_11993814.jpg)
Grusse Ronald
Hallo Ronald,
vielen Dank für Deine Antwort. Gastrotrichen (Bauchhärlinge) sind mehrzellige Wassertiere von ca. 150µ Länge, 30µ Breite und 30µ Dicke. Ein beispielhafter Beitrag von Ole Riemann ist unter http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=22836.0 zu sehen.
Mir geht es darum, die inneren Strukturen (Muskelfasern, Nerven etc.) nach Möglichkeit sichtbar zu machen.
Die von Dir vorgeschlagene Trichrom-Färbung nach Mallory wäre natürlich fantastisch. Ist diese Färbung auch bei Totalpräparaten (Dicke ca. 30µ) und nicht nur bei dünnen Schnitte anwendbar?
Viele Grüsse,
Michael
Hallo Michael,
hast du´s mal mit Polarisation versucht? Muskeln kommen da mitunter sehr schön.
Hallo Klaus,
Polarisation habe ich versucht - funktioniert für den Pharynx recht gut. Die in der Litaratur beschriebenen, langen Muskelzüge habe ich nicht erkennen können.
Viele Grüsse,
Michael
Michael,
Ich denke nicht das es bei 30µm noch Funktioniert weil da wahrscheinlich viel zu viel Farbstoff hängen bleibt und den Schnitt nur Farbe zeigen wird. Probiert aber habe ich es noch nie.
Grüße Ronald
Hallo Ronald,
ja das habe ich auch befürchtet. Trotzdem danke für Deine Mühe.
Grüsse,
Michael
Zitat von: Michael in Oktober 08, 2015, 13:42:47 NACHMITTAGS
Bei den Gastrotrichen hatte ich lediglich einen schwachen, rotvioletten Hintergrund im Gewebe.
Daraus schließe ich, dass:
- das Färbeprotokoll in Ordnung war
- die verwendeten Reagenzien brauchbar waren
- das Hämalaun in den Gastrotrichen eingedrungen ist
- das Hämalaun im Gastrotrichen durch das leicht alkalische Leitungswasser nicht gebläut wurde
Woran das liegt weis ich nicht - vielleicht ist der pH-Wert des Gewebes zu klein, um durch das Wasser über die "Bläuungsschwelle" gehoben zu werden?
Hallo Michael,
Wenn nur der Hintergrund gefaerbt war, deutet das nicht darauf hin, dass der Farbstoff nicht eingedrungen ist? 5 min scheint mir fuer die Tierchen mit Kutikula zu kurz. Ich wuerde vorschlagen: 30 min faerben, auswaschen mit Aqua dest, differenzieren in Acid alcohol (1 % HCl in 70 % Ethanol) - nur so lang, bis das Cytoplasma entfaerbt ist-, auswaschen in Leitungswasser, dann Bläuung.
Zur Bläuung; statt Leitungswassen kann man schnell und unkompliziert eine verduennte Loesung von Natriumhydrogencarbonat verwenden, z.B. Scott's tap water substitute
" (TWS) is an aqueous bluing solution with pH 8, which is an intermediate value along the range of pH within which bluing can occur (i.e., 5 to 11). Scott's TWS is prepared by dissolving in 1 liter of water 2 gm sodium bicarbonate and either 10 gm anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) or 20 gm hydrated magnesium sulfate (MgSO4 ∙ 7H2O [Epsom salts])." http://www.dako.com/28829_2010_conn14_h_e_staining_gill.pdf
Das Fixiermittel kann auch Einfluss auf die Faerbung haben. Sie koennten mal ein alternatives Fixiermittel versuchen.
Beste Gruesse,
Jon
Zitat von: Michael in Oktober 08, 2015, 10:25:18 VORMITTAG
- Kennt jemand eine andere Übersichtsfärbung für Totalpräparate von Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden nach Formol-Fixierung?
Schauen Sie am besten in der Spezialliteratur nach, was fuer Gastrotichen ueblich ist.
Beispiele fuer die Verwendung von HE finde ich auf die schnelle nicht. Verbreitet http://faculty.uml.edu/rhochberg/hochberglab/publications/lepidodasys%20from%20panama.pdf ist die Kontrastierung mit Osmiumtetraoxid und die Einbettung in Glycerol oder Epoxid nach dieser Methode: http://dspace.ucalgary.ca/jspui/bitstream/1880/43426/1/cavey%26cloney_1973.pdf
Wenn es Ihnen aber darum geht, bestimmte Strukturen zu sehen, dann eignen sich Fluoreszenzmethoden besser (Zellkerne: DAPI; Muskeln: Phalloidinkonjugat).
Hallo Jon,
vielen Dank für Ihre Antwort.
Ich habe die bisherigen Antworten zum Anlass genommen, das Färbeprotokoll von H&E zu variieren.
Sie haben recht, bei einer längeren Überfärbung und Auswaschung scheint die Färbung mit Hämalaun zu klappen. Eine Differenzierung ist dann aber, wie Sie schreiben, notwendig. Diese habe ich bei meinen gestrigen Versuchen aber - noch - nicht durchgeführt.
Ich glaube aber, dass ich nun auf einem vernünftigen Weg bin. Sollte ich die nächsten Tage zu vorzeigbaren Ergebnissen kommen, werde ich diese hier posten.
Eine Verwendung von Osmiumtetraoxid kommt für mich als Amateur wohl nicht in Frage. Dazu fehlt mir die notwendige Laborausrüstung. Trotzdem vielen Dank für Ihre interessanten Links.
Beste Grüsse,
Michael
Zitat von: Michael in Oktober 08, 2015, 10:25:18 VORMITTAG
- Kennt jemand eine andere Übersichtsfärbung für Totalpräparate von Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden nach Formol-Fixierung?
Ich bin für jede Idee dankbar.
Hallo Michael
In "Die Bärtierchen" von Hartmut Greven ((Westarp 2004) S. 90 wird ein Färbeprotokoll mit Baumwollgrün angegeben. Ich wüsste allerdings nicht, ob man das noch bekommt. Bei Chroma hab ich es nicht gesehen.
Viele Mikrogrüße
Bernhard
Hallo Bernhard,
danke für Deinen Hinweis auf Baumwollgrün. Leider finde ich weder im Web noch in alten Büchern eine Referenz auf Baumwollgrün. Vielleicht ist das eine alte Bezeichnung für einen heute noch gängigen Farbstoff? So wurde z.B. Metylblau früher wohl auch Baumwollblau genannt. Auch im Englischen ist die Bezeichnung "direct cotton dye" üblich.
Viele Grüsse,
Michael
Zitat von: Michael in Oktober 14, 2015, 08:53:51 VORMITTAG
Hallo Bernhard,
danke für Deinen Hinweis auf Baumwollgrün. Leider finde ich weder im Web noch in alten Büchern eine Referenz auf Baumwollgrün. Vielleicht ist das eine alte Bezeichnung für einen heute noch gängigen Farbstoff? So wurde z.B. Metylblau früher wohl auch Baumwollblau genannt. Auch im Englischen ist die Bezeichnung "direct cotton dye" üblich.
Viele Grüsse,
Michael
Das ist ein interessanter Aspekt, das könnte natürlich Methylgrün sein.( das sollte mich wundern, wenn das hier in der Runde niemand wüsste!!) Das gibt es bei Chroma, das hab ich sogar hier!
Übrigens gibt es für Nematoden in "Fadenwürmer" von Arwed H. Meyl (grüne Kosmosreihe) ein Färbeprotokoll mit Baumwollblau. Dabei werden die fixierten Tiere in Lactophenol gebracht, das Baumwollblau (0,01%!!) ins Lactophenol gebracht und das ganze auf 60-65° erwärmt. (Stark verkürzt-ich kann Dir die Protokolle als Scans gerne zukommen lassen.)
Möglicherweise lohnt sich auch bei Gastrotrichen ein Versuch.
Viele gastrotriche Mikrogrüße
Bernhard
Hallo,
also in meiner Literatur der Farbstoffe wird das Baumwollgrün auch nirgends aufgeführt - und ich habe wirklich eine Menge!
Baumwollfarbstoffe sind oft Diazo-Farbstoffe da würde sich Diamingrün anbieten (Alternative Direkttiefschwarz).
Das bekannte Baumwollblau ist allerdings ein Triphenylmethan-Derivat. Hier würde dann Malachitgrün passen und sehr ähnlich Brillantgrün: Methylgrün gehört auch in diese Reihe und ist der heute gebräuchlichste Farbstoff. Könnte also wirklich sein, dass das eigentlich gemeint war. Käme auf einen Versuch an. Die Färbungen sind nicht sehr gut haltbar und die Farbstofflösung auch nicht (bei mir hat sich eine mal nach einem Jahr komplett entfärbt.)
Edit: ich lese gerade Bernhards Beitrag. Lactophenolblau habe ich kürzlich frisch angesetzt, weil ein Kollege welches wollte -falls du es nicht hast...
Zitat von: Klaus Herrmann in Oktober 14, 2015, 12:53:08 NACHMITTAGS
Hallo,
also in meiner Literatur der Farbstoffe wird das Baumwollgrün auch nirgends aufgeführt - und ich habe wirklich eine Menge!
.
Hallo Klaus
also wenn Du das schon sagst!! Vielleicht hat sich Herr Greven verhauen und meinte Baumwollblau!
Bei genauerem lesen sind meine beiden erwähnten Protokolle (Greven und Meyl) ansonsten identisch.
Michael, ich würd das mal mit damit probieren!
Viele Mikrogrüße
Bernhard
Nachtrag: Sag mal Michael, bist Du sicher, dass eine Färbung überhaupt nötig ist? So richtig was finden konnte ich im Netz darüber nicht. Hast Du wirklich alle Kontrastverfahren (Dunkelfeld, schiefe Beleuchtung, eventuell DIK) ausprobiert?
Hallo in die Runde,
es freut mich, das dieses Thema doch auf ein reges Interesse trifft.
Die Frage, ob sich eine Färbung von Gastrotrichen lohnt, kann ich wohl nur beantworten, wenn ich ein paar Beispiele von Lepidodermella squamata zeige. Die Fotos sind praktisch nicht bearbeitet und waren nur als "interne Dokumentation" gedacht - also bitte nicht zu viele Ansprüche an die Qualität stellen. DIK oder Fluoreszenz stehen mir nicht zu Verfügung.
1. Vergleich ungefärbt - gefärbt mir Hämalaun:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/179975_2504261.jpg)
Im ungefärbten Zustand (Bild A) erkennt man eine Menge Einzelheiten (z.B. Beschuppung, Cilien etc.). Die Differenzierung des Gewebes ist aber recht kontrastarm. Bild B wurde mit Hämalaun gefärbt und in Euparal eingeschlossen. Obwohl die Aufnahme schlecht und unscharf ist, die Färbung nicht gut ausgefallen ist, erkennt man die Zellkerne und die dazugehörigen Gewebestrukturen. Wenn das Präparat ausgetroknet ist und ich mich mit Ölimmersion drantraue, hoffe ich doch, eine Menge interessanter Einzelheiten zu sehen, die mir im ungefärbten Zustand nicht zugänglich waren.
2. Kernfärbung mit Methylgrün
Im ungefärbten Zustand sind die Zellkerne nur schwer zu sehen. Mit Methylgrün kann man diese gut hervorheben:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/179975_45582897.jpg)
Man erkennt z.B. recht schön die Struktur des Gehirns.
3. Elektive Vitalfärbung des Gehirns mit Methylblau
Mit dieser Färbung kann man die Gehirnstruktur einigermassen hervorheben:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/179975_37964453.jpg)
Bild A: Seitenansicht, B: von Vorne. Zugegebenermassen ist diese Färbung nicht schön ausgefallen - dennoch erkennt man den Zellverband besser als im ungefärbten Zustand.
Ich glaube also schon, dass eine Färbung im Vergleich zum ungefärbten Zustand andere Details sichtbar machen kann. Lebendbeobachtung und Färbung ergänzen sich meiner Meinung nach und zeigen jeweils andere Details.
Zu der vorgeschlagenen Färbung:
Laktophenolblau war mir bis jetzt nur für die Färbung von Pilzen bekannt. Welche Resultate hätte man denn zu erwarten (Kernfärbung, Plasmafärbung)?
Für tierische Gewebe hätte ich mehr an Methylblau-Eosin-Färbung nach Mann (Biazid) gedacht. Ich habe aber keine Ahnung, ob das nur für Schnitte sinnvoll ist.
Bernhard, für eine Kopie des Färbeprotokolls der Baumwollblau-Färbung wäre ich dankbar.
Klaus, auf dein Angebot komme ich gerne zurück, wenn ich mich über die Färbung etwas schlau gemacht habe.
Ebenfalls viele gastrotriche Mikrogrüße,
Michael
Hallo Thilo,
eine CAS-Nummer für das verwendete Methylgrün kann ich Dir nicht angeben. Ich habe die fertige Färbelösung von Klaus Herrmann bekommen - vielleicht kann er Dir da weiterhelfen.
Die Rezeptur ist die aus der Literatur bekannte: 0,1g Methylgrün, 100ml dest. Wasser, 1ml Eisessig
Das Zellkernbild, das ich mit Methylgrün erhalten habe, ist bei allen untersuchten Tieren vergleichbar und korreliert auch mit der alten Literatur zu den Gastrotrichen. Damals wurde ja auch noch mit entsprechenden Färbungen gearbeitet (meist Karmin). Auch die unterschiedlichen Kerngrößen - vor allem bei den Nervenzellen, in die die Tasthaare münden - wurde bereits beschrieben. Auch ein Vergleich der Kerne mit den Hämalaunfärbungen (bei denen die Kernfärbung zwar sichtbar, aber leider nicht sehr scharf ist) zeigt das selbe Bild.
Die Motivation bei der Suche nach einer Übersichtsfärbung ist es gerade, zusätzlich zu den Kernen auch das Plasma kontrastierend anzufärben. Ich hoffe so, den gesamten Zellverbund besser erkennen zu können. Nur aus den Zellkernen ist es schwer, den Zusammenhang der Zellen zu beurteilen.
Bei den bis jetzt durchgeführten Versuchen, glaube ich, die beiden Nervenstränge, die sich wohl aus Einzelzellen zusammensetzen, erkennen zu können. Muskelstränge konnte ich übehaupt nicht sehen (mag aber an dem Beobachter liegen). Es klingt für mich deshalb sehr plausibel, dass sich diese Muskelstränge nicht primär aus einzelnen Muskelzellen zusammensetzen.
Auf die Färbungen mit Methylenblau möchte ich eigendlich nicht näher eingehen, da ich mit dem Ergebniss nicht zufrieden bin. Die Idee dahinter ist, dass die Tiere einige Zeit in einer sehr schwachen Lösung überleben und das sich in dieser Zeit primär die Nervenzellen färben. Das Ergebniss ist ziemlich stark von Konzentration und Timing abhängig. Vielleicht mache ich irgendwann mal nähere Versuche.
Gruß,
Michael
ZitatIch habe die fertige Färbelösung von Klaus Herrmann bekommen - vielleicht kann er Dir da weiterhelfen.
Die Rezeptur ist die aus der Literatur bekannte: 0,1g Methylgrün, 100ml dest. Wasser, 1ml Eisessig
Ich erinnere mich schwach...Methylgrün Merck Art Nr 1314 C.I. Nr. 42585 S.R.Nr. 788
hoffe damit geholfen zu haben!
Hallo Thilo,
danke für deine Recherche. Der "ordentliche" Chemiker will deshalb immer die Strukturformel sehen. So wie der "ordentliche" Biologe die wissenschaftliche Bezeichnung dem Trivialnamen vorzieht - aber auch da gehts oft durcheinander.
Beruhigend ;D der Nachsatz:
ZitatIn many cases, if not all, ethyl green is likely the dye actually provided when methyl green is purchased.
Letztlich hilft nur das Färbe-Ergebnis und im Zweifel die Angabe:
habe den Farbstoff aus diesem Gefäß entnommen!
Hallo Thilo,
ich bin gespannt auf Deine Ergebnisse.
Ich weis nicht, ob Du vor hast, die Tiere vor dem Färben (oder durch die Färbung) zu fixieren. Wenn ja, müssten dabei einige Tricks beachtet werden.
Vielleicht ist das ja alles für Dich ein alter Hut, aber ich möchte dennoch kurz berichten, wie ggf. die Fixierung klappt.
Das Problem ist, das sich die Tiere beim Sterben zu einer Kugel zusammenrollen. Für eine weitere Untersuchung sind sie dann oft nicht mehr verwendbar. Um sie im gestreckten Zustand zu fixieren wende ich zwei Methoden an:
1. Fixieren unter dem Deckglas
Man legt die Tiere mit dem Deckglas fest und zieht Fixativ unter das Deckglas. Dadurch haben die Gastrotrichen meist nicht mehr den Platz, sich stark zu verkrümmen.
Vorteil: recht einfache Vorgehensweise
Nachteile: Das Tier klebt am DG oder am Objektträger fest und kann meist nicht mehr in andere Reagenzien überführt werden. Eine Färbung müsste dann auch unter dem DG erfolgen. Ein Dauerpräparat ist schwer möglich. Zum Fixieren sollte man nach Möglichkeit eine etwas stärkere Formaldehyd-Lösung verwenden, da die Zugabe der Fixierung die Schichtdicke des Präparates erhöht und die Tiere u. U. dann noch genügend Zeit haben, sich zu verkrümmen.
2. Freies Fixieren
Will man den Tieren nicht mechanisch die Möglichkeit zum Verkrümmen nehmen, muss man vor dem Fixieren die Tiere mit ca. 1%-Lösung von MgCl2 betäuben. Nach wenigen Minuten sinken sie entspannt zu Boden. Jetzt kann man problemlos mit den üblichen 4% Formaldehyd fixieren (Fixierungsdauer für Dauerpräparate min. 24h).
Ich habe mir eine ca. 2% Lösung von Magnesiumchlorid gemacht und gebe einfach etwa die selbe Menge wie Probenwasser zum Probenwasser.
Vorteile: Meist völlig entspannte Tiere; Problemloses Überführen in andere Reagenzien; Dauerpräparate möglich.
Nachteile: etwas umständlicher
Ich wünsche Dir viel Erfolg bei Deinen Versuchen.
Michael
Hallo Thilo,
natürlich hast Du recht - bei allen Färbungen ist das Resultat von Fixierung und Differenzierung abhängig.
Bei der von mir angewandten Hämalaun-Färbung nach Mayer hatte ich aber - selbst bei sehr langem Aufenthalt in der Färbelösung - bei Algen und Einzellern noch nie eine Überfärbung bemerkt. Im Allgemeinen ist diese Färbung auch als recht tolerant bekannt. Ein Einfluss der Fixierung war bei mitgefärbten Algen - die dieselbe Fixierung durchliefen wie die Gastrotrichen - nicht zu bemerken. Bei Gastrotrichen kommt es erst zu einer erkennbaren Färbung, wenn die Färbe- und Bläuungszeiten lange ausgedehnt werden. Die benötigten Zeiten scheinen extrem von der Größe des Tieres (oder von deren Alter) abzuhängen. So musste ich für junge Exemplare ca. 20 min Färben, 1h (bei öfter gewechselten Leitungswasser) bläuen. Ältere Tiere benötigten dann schon 1h Färbung / 12h Bläuen. Der Versuch einer Differenzierung mit angesäuertem Alkohol schlug fehl - vielleicht habe ich auch nicht die benötigte Zeitdauer getroffen. Das Ergebnis der Färbungen war dementsprechend bescheiden: Das gesamte Gewebe war diffus mitgefärbt; die Zellkerne hoben sich schlecht vom Untergrund ab. Letztendlich bin ich mit dieser Färbung - die ansonsten problemlos klappt - nicht zurechtgekommen.
Woran die Probleme mit Hämalaun liegen, kann ich nicht sagen. Da andere Färbungen problemlos einziehen, glaube ich eigentlich nicht, dass es an der derben Cuticula der Tiere liegt. Eosin, Methylgrün, Methylenblau, ja selbst einfache Lebensmittelfarben ziehen rasch ein und ergeben in Minuten die erwarteten Ergebnisse.
Inzwischen habe ich im Buch von Mayer (dem vom Hämalaun) gelesen, dass er für die Färbung von Nematoden und Rädertiere nur Karmin empfehlen kann - Hämalaun brächte nur bescheidene Ergebnisse. Auch Gastrotrichen-Altmeister Zelinka hat seine Exemplare nur mit Karmin gefärbt - in einer Zeit, in der Hämatoxylinfärbungen bereits Standard waren. Meine Ergebnisse reihen sich da wohl nahtlos ein.
Ich werde versuchen, mir eine Karmin-Färbung zu besorgen und diese zu testen. Weitere Versuche mit Hämalaun wären nur ein Stochern im Nebel, zumal die Durchführung der Färbung aufgrund der diffizilen mechanischen Handhabung der kleinen Tiere ziemlich aufwändig ist.
Hoffnungsvolle Grüße,
Michael
Zitat von: Michael in Oktober 21, 2015, 10:12:04 VORMITTAG
... So musste ich für junge Exemplare ca. 20 min Färben, 1h (bei öfter gewechselten Leitungswasser) bläuen. Ältere Tiere benötigten dann schon 1h Färbung / 12h Bläuen. Der Versuch einer Differenzierung mit angesäuertem Alkohol schlug fehl - vielleicht habe ich auch nicht die benötigte Zeitdauer getroffen. Das Ergebnis der Färbungen war dementsprechend bescheiden: Das gesamte Gewebe war diffus mitgefärbt; die Zellkerne hoben sich schlecht vom Untergrund ab. Letztendlich bin ich mit dieser Färbung - die ansonsten problemlos klappt - nicht zurechtgekommen.
Woran die Probleme mit Hämalaun liegen, kann ich nicht sagen. Da andere Färbungen problemlos einziehen, glaube ich eigentlich nicht, dass es an der derben Cuticula der Tiere liegt. Eosin, Methylgrün, Methylenblau, ja selbst einfache Lebensmittelfarben ziehen rasch ein und ergeben in Minuten die erwarteten Ergebnisse. ...
Michael
Guten Tag Michael!
Zwei Fragen, um wieder eine Fehlerquelle auszuschließen. Wie sicher sind Sie sich, daß aus der Wasserleitung tatsächlich basisches Wasser fließt? Im Labor einer Forschungseinrichtung habe ich einmal erlebt, daß die Hauswasserleitung Leitungswasser vom pH-Wert 6,5 abgab. So kann das mit Hämatoxylinfärbungen selbstverständlich nicht funktionieren.
Wichtung bei Hämalaun nach Mayer ist auch die ständige Kontrolle unter dem Mikroskop, weil sich eine Überfärbung nicht gut mit Aqu. dest. auswaschen läßt.
Haben Sie Ihre Arbeitsweise anhand von Gerlachs Botanischer Mikrotechnik, und auch in Romeis' Mikroskopischer Technik, 16. Auflage 1968, nachgeprüft?
Bitte entschuldigen Sie diese Fragen, aber ich habe diesen Faden nicht intensiv verfolgt und weiß nicht, was alles schon mitgeteilt wurde.
Ich selbst hätte nicht mit Hämalaun gefärbt, sondern mit Hämatoxylin nach Ehrlich oder nach Weigert.
Wenn Sie eine Gegenfärbung mit Karminessigsäure versuchen möchten, beachten Sie, daß die Angabe bei Romeis 4-5 g pulv. Karmin viel zu viel ist und anschließend zu komplizierten Prozeduren führt. 0,5 - 0,75 g sind völlig ausreichend, wie Dr. Krauter (Mikrokosmos 66, 1977, S. 127) nachgewiesen hat.
Guten Erfolg!
KH
Hallo Hr. Henkel,
danke für Ihr Interesse.
Das Leitungswasser ist bei uns so kalkhaltig, dass es keine Probleme geben sollte. Um das zu prüfen, habe ich im gleichen Färbegang einige Algen mitgefärbt und bei diesen eine einwandfreie und kontrastreiche Kernfärbung erhalten. Dennnoch habe ich mit Natriumbikarbonat versetztes Wasser ausprobiert - ebenfalls kein vernünftiges Ergebnis.
Die Färbung erfogte unter ständiger mikroskopischen Kontrolle mittels einer Färbebrücke. Während des Färbevorgangs konnte ich zu keinem Zeitpunkt die Zellkerne klar identifizieren. Erst das Bläuen hat diese etwas klarer hervorgehoben.
Ich glaube, Hämalaun ist - zumindest in meinen Händen - nicht für Totalpräparate von Gastrotrichen geeignet. Ich werde deshalb demnächst Boraxkarmin und alternativ Eisenhämatoxylin nach Weigert ausprobieren.
Viele Grüße,
Michael Müller
Hallo Thilo,
schön, dass Du doch noch einen Gastrotrichen erwischt hast.
Eigendlich wollte ich meine suboptimalen Zwischenergebnisse hier nicht zeigen, aber wenn es Dir weiterhilft...
Also frei nach dem Motto: "Ist der Ruf erst ruiniert, färbt es sich ganz ungeniert!"
1. Methylgrün
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/180634_16320842.jpg)
Bild A&B: Dorsale Ansicht
Bild C&D: Fokus etwa auf die Mitte
Bild E&F: Ventrale Ansicht
Beiderseits des Pharynx liegt das Cerabralganglion, das seitlich ventral jeweils in ein Horn ausläuft und sich dann in einem Nervenstrang fortsetzt, der rund um das Tier läuft. Ansatzweise glaube ich das erkennen zu können. Am Hinterende zeichnen sich die Klebedrüsen und das Ovar ab. Über das gesamte Tier verteilt zeichnen sich die Hautzellen ab, die ein Syncytium bilden. Welche Zellkerne zu dem Darm gehören, kann ich nicht erkennen. Die Darmzellen sind die größten Zellen im Tier und bilden (lt. Literatur) vier Säulen mit jeweils ca. 8 Zellen.
Es würde mich interessieren, ob Deine Kernbilder eine vergleichbare Grobstruktur abbilden.
2. Hämalaun
Meine Hämalaunversuche habe ich aufgegeben, da ich nicht in der Lage war, wirklich aussagekräftige Färbungen zu produzieren.
Einer meiner letzten Versuche:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/180634_63349250.jpg)
3. Vergleich zu Deinen Bildern von dem Rädertier
Bei Deinem Bild ist mir aufgefallen, dass bei Deiner Vitalfärbung hauptsächlich der "Vorderteil" und der "Schwanzteil" gefärbt wurde. Das selbe Verhalten zeigten die Gastrotrichen bei der Vitalfärbung mit Methylenblau:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/180634_32143994.jpg)
Deshalb hatte ich die Vermutung, dass der Mechanismus zur Aufnahme des Farbstoffes vielleicht ähnlich ist. Leider sind die Gastrotrichen bald verstorben, bevor ich die weitere Farbverteilung beobachten konnte. Nach dem Tod tritt eine diffuse Färbung des gesamten Tieres ein. Vielleicht vertragen die Tiere Deinen Farbstoff länger? Es würde mich interessieren, ob einzelne Regionen (Organe) wieder entfärbt werden, während andere Farbe aufnehmen.
Die anderen Färbelösungen (Boraxkarmin etc. ) sollte ich erst heute erhalten. Weiter Ergebnisse sind deshalb nicht vor dem nächsten Wochenende zu erwarten.
Nochmals Enschuldigung für die Qualität meiner Fotos.
Viele Grüße,
Michael
Hallo Thilo,
Glückwunsch zu dem schönen Erfolg und danke für Deine ermutigenden Worte.
Zitat von: paramecium in Oktober 26, 2015, 20:21:20 NACHMITTAGS
Ich weiß gar nicht was Du hast, die Darstellung der Schuppen ist doch wunderbar und sicherlich brauchbar für die Bestimmung. Man muss sich halt auf die Details konzentrieren. Ich sehe in den gefärbten Aufnahmen jedoch nicht unbedingt, dass Position der Zellkerne mit diesen Schuppen korrelieren. Bei meinem konnte ich keine Schuppen finden, weder visuell, noch in den Aufnahmen. Erinnere mich jedoch, dass es mir bei einem anders gestalteten Bauchhärling einmal aufgefallen ist.
Ja, für die Bestimmung reichen meine Fotos: Lepidodermella squamata. Die Schuppen korrelieren nicht mit den Hauzellen. Die Haut bildet ein Syncytium (Epithelverband mit vielen Zellkernen, aber ohne Zellgrenzen). Die Schuppen sind also nicht an Einzelzellen gebunden. Ich denke, Dein Exemplar wird wohl auch Schuppen besitzen, die sich aber erst bei kleinerer Schichtdiche zeigen. Ohne die Schuppen ist eine Bestimmung (zumindest für mich) nicht möglich.
Zitat von: paramecium in Oktober 26, 2015, 20:21:20 NACHMITTAGS
Ich habe daher eine andere Sekunde gewählt, um der Schande zu entgehen und bei der ein Ei(?) sichtbar wurde. Vielleicht kannst Du mehr dazu erklären oder es beschriften.
Bei Deinem Exemplar ist in der Tat ein Ei sichtbar. Mir ist auch nie gelungen den Kern der Eizelle zu färben.
Die Zellkerne am "Kopfende" gehören zu Zellen des Cerebralganglions. Es zeigt sich sehr schön das typische, symmetrische Muster der beiden Seitenlappen, die am Vorderende verbunden sind. (etwas weiter zum Hinterende hin gibt es nochmals eine Zellbrücke). Sehr schön ist auch die unterschiedliche Größe der Einzelkerne zu erkennen. Soweit ich das bei mir erkennen konnte, haben die Zellen, in die die Tasthaare münden, auffallend große Zellkerne.
Besonders gefällt mir das Bild des Pharynx mit den sechs symmetrisch angeordneten Zellkernen. Auf dem kleinen Bild kann ich es nicht genau erkennen, aber diese Zellkerne haben bei mir eine längliche, eher spindelförmige Form. So kontrastreich wie bei Dir habe ich diese Kerne noch nicht gesehen.
Am Hinterende wurden wohl die Klebedrüsen gefärbt.
Ich finde es frappierend, dass Vitalfärbungen mit Fluoreszenzfarbstoffen ähnlich funktionieren wie mit "normalen" Farbstoffen (wobei mich das eigendlich nicht überraschen sollte, da die zugrundeliegenden Transportmechanismen wohl die gleichen sind). Der Vorteil der Vitalfärbungen ist dann die Selektivität auf einige Zelltypen (bzw. Organe). Der Nachteil, dass man wohl nur schwer (wenn überhaupt) erreichen kann, dass das gesamte Zellgefüge gefärbt wird.
Inzwischen habe ich eine Färbung mit Eisenhämatoxylin nach Weigert durchgeführt. Die ersten Ergebniss sind sehr ermutigend. Resultate folgen, wenn die Dauerpräparate einigermassen troken sind.
Viele Grüsse,
Michael
Soeben beim Blättern wiederentdeckt:
Gastrotricha. 5 Seiten (Bildtafeln) mit 31 hervorragenden, farbigen DIK-Mikrofotos von Martin Kreuz. In:
Protozoological Monographs. Volume 3: issued April 2006.
Martin Kreuz and Wilhelm Foissner:
The Sphagnum Ponds of Simmelried in Germany: A Biodiversity Hot-Spot for Microscopic Organisms. 267 Seiten. S. 235-239
Shaker Verlag Aachen, 2006. ISBN 3-8322-2544-7
Nur als Hinweis.
Grüße an alle Gastro-Liebhaber!
KH
Hallo in die Runde,
wie versprochen möchte ich Euch die ersten Ergebnisse mit der Eisen-Hämatoxylin-Färbung nach Weigert (EHW) zeigen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/180806_40967001.jpg)
Bild 1: Übersichtsbild Lepidodermella squamata; EHW; Achromat 100 Öl; Euparal
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/180806_31575752.jpg)
Bild 2: Kopfbereich mit Cerebralganglion; EHW;Achromat 100 Öl; s/w; Euparal
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/180806_11622703.jpg)
Bild 1: Hinterende; EHW;Achromat 100 Öl; s/w; Euparal
Die Färbung klappt problemlos und in Minutenschnelle. Das Resultat ist eine scharfe,schwarze Kernfärbung und eine zarte, durchscheinende Graufärbung des Plasmas. Dadurch bleibt, zusätzlich zu den Kernen, der Zusammenhang des Gewebes ersichtlich. Da die Plasmafärbung einigermaßen transparent verbleibt, ist ein Durchfokussieren in tiefere Gewebeschichten möglich.
Es ist schwer, mit den Fotos, die wohl den Limit meiner fotografischen Fähigkeiten darstellen, die Faszination zu vermitteln, mit der man die inneren Strukturen dieser Winzlinge verfolgen kann.
In Bild 2 erkennt man z.B. sehr schön das zu beiden Seiten des Pharynx liegende und diesen an dem Vorderende überdeckende Cerebralganglion. Die Zellen, in die die Tasthaarbüschel münden (also wohl Sinneszellen) haben jeweils einen auffallend vergrößerten Zellkern. Das Cerebralganglion taucht dann beidseitig ventral ab und bildet zwei "Hörner" aus, die sich dann in einer langen Reihe von Nervenzellen als eine Nervenfaser nach hinten fortsetzen bis sie unter den Ovarien nicht mehr erkennbar werden. Caudal scheinen sie dann wieder aufzutauchen und sich mit der Faser der anderen Seite vor den Klebedrüsen wieder zu vereinen. Gut zu erkennen sind auch die Klebe- bzw. Lösedrüsen, die sich in den Ausführungsgang der Kleberöhrchen hineinziehen und die so manchen Pipettierversuch von mir vereitelt haben.
Ich denke also, eine recht befriedigende Färbung gefunden zu haben und glaube nicht, dass man bei dieser Objektdicke viel mehr erwarten kann. Zumindest ist es so möglich den inneren Aufbau dieser mehrzelligen Tiere, die im Vergleich zu so manchem Einzeller Winzlinge sind, bequem zu untersuchen. Jetzt ist wohl erstmal Literaturrecherche angesagt, um die Beobachtungen richtig einordnen zu können.
Ich möchte mich für Eurer großes Interesse bedanken, das mir den Mut gegeben hat, dieses Projekt bis zu seinem einigermaßen befriedigendem Ende weiterzuverfolgen. Ich war die letzten Monate mehr als einmal kurz davor, die Flinte ins Korn zu werfen.
Herzliche Grüße,
Michael
Hallo Michael,
freut mich dass die Färbung so gut klappt. Ich hatte die Hämatoxilin-Lösung ja frisch angesetzt, aber offensichtlich hat die kurze Zeit zur Reifung schon ausgereicht.
Eine Frage: gelingt es davon Dauerpräparate herzustellen, oder sind die Objekte zu empfindlich?
Hallo Klaus,
ja, die Objekte sind empfindlich, aber die obigen Fotos stammen von Dauerpräparaten. Wenn man es erst einmal geschafft hat, die Gastrotrichen auf einem Deckglas festzukleben, kann man die weitere Färbung und Entwässerung mit einer Färbebrücke recht bequem durchführen.
Grüße,
Michael