Welche Übersichtsfärbung für Gastrotrichen?

Michael Müller · Oktober 08, 2015, 10:25:18 VORMITTAG

Hallo in die Runde
Ich habe in der letzten Zeit versucht, Gastrotrichen mit Hamalaun zu färben. Obwohl andere Färbungen (Methylgrün, Methylenblau, Eosin) problemlos geklappt haben, ist die H&E-Übersichtsfärbung vollständig misslungen. Das Hämaleun lässt sich bei den Totalpräparaten (warum auch immer) nicht "bläuen" und ergibt bestenfalls einen diffusen Hintergrund.
Deshalb bin ich auf der Suche nach einer anderen Übersichtsfärbung. In der Literatur wird Boraxkarmin empfohlen. Gleichzeitig lese ich aber, das diese Färbung bei Formol-Fixierung sehr schlecht ausfällt. Deshalb meine Fragen:

Hat jemand Erfahrung mit Boraxkarmin nach einer Fixierung mit Formol?
Ist Boraxkarmin für Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden geeignet?
Kennt jemand eine andere Übersichtsfärbung für Totalpräparate von Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden nach Formol-Fixierung?

Ich bin für jede Idee dankbar.

Freundliche Grüsse,

Michael

Klaus Henkel · Oktober 08, 2015, 11:38:48 VORMITTAG

Zitat von: Michael in Oktober 08, 2015, 10:25:18 VORMITTAG
...
Ich habe in der letzten Zeit versucht, Gastrotrichen mit Hamalaun zu färben. Obwohl andere Färbungen (Methylgrün, Methylenblau, Eosin) problemlos geklappt haben, ist die H&E-Übersichtsfärbung vollständig misslungen. Das Hämaleun lässt sich bei den Totalpräparaten (warum auch immer) nicht "bläuen" und ergibt bestenfalls einen diffusen Hintergrund.
Deshalb bin ich auf der Suche nach einer anderen Übersichtsfärbung. In der Literatur wird Boraxkarmin empfohlen. Gleichzeitig lese ich aber, das diese Färbung bei Formol-Fixierung sehr schlecht ausfällt. Deshalb meine Fragen:

Hat jemand Erfahrung mit Boraxkarmin nach einer Fixierung mit Formol?
Ist Boraxkarmin für Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden geeignet?
Kennt jemand eine andere Übersichtsfärbung für Totalpräparate von Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden nach Formol-Fixierung?

Ich bin für jede Idee dankbar.
...
Michael

Guten Tag Michael!

Um feststellen oder wenigstens vermuten zu können, ob und welche Verarbeitungsfehler vorliegen, muß man sehr präzise und ausfühlrlich darlegen, wie Sie gearbeitet haben, welche Färbevorschriften Sie befolgt haben und wo sie veröffentlicht sind: Verfasser, Titel, Auflage, Seite. Erst dann ist nachvollziehbar, wie Sie vorgegangen sind.

Ohne diese Angaben, müssen Sie abwarten, ob jemand einen genialen Geistesblitz hat. Ich selbst glaube lieber an exakte Angaben als an Geistesblitze.

Sie sind wieder am Zug!

Grüße
KH

Michael Müller · Oktober 08, 2015, 13:42:47 NACHMITTAGS

Hallo Hr. Henkel,
vielen Dank für Ihre Antwort.
Mein erster Gedanke war auch, dass ich bei der Hämalaun-Färbung (nach Mayer) irgend etwas falsch gemacht habe. Ich habe eine käufliche Lösung verwendet und nach dem Standard-Färbeprotokoll gearbeitet (5min Hämalaun, Auswaschen, 15 min Bläuen in leicht alkalischem Leitungswasser).
Um meine Vorgehensweise und die Qualität der Färbelösung zu überprüfen, habe ich zur Kontrolle in dem gleichen Färbegang einige Algen mitgefärbt. Die Färbeergebnisse bei den Algen waren OK - kontrastreiche und scharfe Kernfärbung. Bei den Gastrotrichen hatte ich lediglich einen schwachen, rotvioletten Hintergrund im Gewebe.
Daraus schließe ich, dass:

das Färbeprotokoll in Ordnung war
die verwendeten Reagenzien brauchbar waren
das Hämalaun in den Gastrotrichen eingedrungen ist
das Hämalaun im Gastrotrichen durch das leicht alkalische Leitungswasser nicht gebläut wurde

Woran das liegt weis ich nicht - vielleicht ist der pH-Wert des Gewebes zu klein, um durch das Wasser über die "Bläuungsschwelle" gehoben zu werden?

Meine Frage ist also, ob es noch andere, empfehlenswerte Übersichtfärbungen gibt?

Grüße,

Michael Müller

Ronald Schulte · Oktober 08, 2015, 21:00:27 NACHMITTAGS

Michael,

Ich weis zwar nicht was Gastrotrichen sind aber wenn es Tierliches Gewebe ist Farbe ich sehr gerne mit die Trichrom nach Frank Burr Mallory.
Einfach durch zu fuhren und gelingt auch an Formol Fixiertes Gewebe.

Grusse Ronald

Michael Müller · Oktober 09, 2015, 10:18:07 VORMITTAG

Hallo Ronald,
vielen Dank für Deine Antwort. Gastrotrichen (Bauchhärlinge) sind mehrzellige Wassertiere von ca. 150µ Länge, 30µ Breite und 30µ Dicke. Ein beispielhafter Beitrag von Ole Riemann ist unter http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=22836.0 zu sehen.
Mir geht es darum, die inneren Strukturen (Muskelfasern, Nerven etc.) nach Möglichkeit sichtbar zu machen.

Die von Dir vorgeschlagene Trichrom-Färbung nach Mallory wäre natürlich fantastisch. Ist diese Färbung auch bei Totalpräparaten (Dicke ca. 30µ) und nicht nur bei dünnen Schnitte anwendbar?

Viele Grüsse,
Michael

Klaus Herrmann · Oktober 09, 2015, 10:20:49 VORMITTAG

Hallo Michael,

hast du´s mal mit Polarisation versucht? Muskeln kommen da mitunter sehr schön.

Michael Müller · Oktober 09, 2015, 10:36:38 VORMITTAG

Hallo Klaus,
Polarisation habe ich versucht - funktioniert für den Pharynx recht gut. Die in der Litaratur beschriebenen, langen Muskelzüge habe ich nicht erkennen können.

Viele Grüsse,
Michael

Ronald Schulte · Oktober 09, 2015, 20:45:49 NACHMITTAGS

Michael,

Ich denke nicht das es bei 30µm noch Funktioniert weil da wahrscheinlich viel zu viel Farbstoff hängen bleibt und den Schnitt nur Farbe zeigen wird. Probiert aber habe ich es noch nie.

Grüße Ronald

Michael Müller · Oktober 10, 2015, 12:54:53 NACHMITTAGS

Hallo Ronald,
ja das habe ich auch befürchtet. Trotzdem danke für Deine Mühe.

Grüsse,

Michael

JB · Oktober 11, 2015, 15:43:41 NACHMITTAGS

Zitat von: Michael in Oktober 08, 2015, 13:42:47 NACHMITTAGS
Bei den Gastrotrichen hatte ich lediglich einen schwachen, rotvioletten Hintergrund im Gewebe.
Daraus schließe ich, dass:

das Färbeprotokoll in Ordnung war
die verwendeten Reagenzien brauchbar waren
das Hämalaun in den Gastrotrichen eingedrungen ist
das Hämalaun im Gastrotrichen durch das leicht alkalische Leitungswasser nicht gebläut wurde
Woran das liegt weis ich nicht - vielleicht ist der pH-Wert des Gewebes zu klein, um durch das Wasser über die "Bläuungsschwelle" gehoben zu werden?

Hallo Michael,

Wenn nur der Hintergrund gefaerbt war, deutet das nicht darauf hin, dass der Farbstoff nicht eingedrungen ist? 5 min scheint mir fuer die Tierchen mit Kutikula zu kurz. Ich wuerde vorschlagen: 30 min faerben, auswaschen mit Aqua dest, differenzieren in Acid alcohol (1 % HCl in 70 % Ethanol) - nur so lang, bis das Cytoplasma entfaerbt ist-, auswaschen in Leitungswasser, dann Bläuung.

Zur Bläuung; statt Leitungswassen kann man schnell und unkompliziert eine verduennte Loesung von Natriumhydrogencarbonat verwenden, z.B. Scott's tap water substitute
" (TWS) is an aqueous bluing solution with pH 8, which is an intermediate value along the range of pH within which bluing can occur (i.e., 5 to 11). Scott's TWS is prepared by dissolving in 1 liter of water 2 gm sodium bicarbonate and either 10 gm anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) or 20 gm hydrated magnesium sulfate (MgSO4 ∙ 7H2O [Epsom salts])." http://www.dako.com/28829_2010_conn14_h_e_staining_gill.pdf

Das Fixiermittel kann auch Einfluss auf die Faerbung haben. Sie koennten mal ein alternatives Fixiermittel versuchen.

Beste Gruesse,

Jon

JB · Oktober 11, 2015, 16:08:48 NACHMITTAGS

Zitat von: Michael in Oktober 08, 2015, 10:25:18 VORMITTAG
Kennt jemand eine andere Übersichtsfärbung für Totalpräparate von Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden nach Formol-Fixierung?

Schauen Sie am besten in der Spezialliteratur nach, was fuer Gastrotichen ueblich ist.

Beispiele fuer die Verwendung von HE finde ich auf die schnelle nicht. Verbreitet http://faculty.uml.edu/rhochberg/hochberglab/publications/lepidodasys%20from%20panama.pdf ist die Kontrastierung mit Osmiumtetraoxid und die Einbettung in Glycerol oder Epoxid nach dieser Methode: http://dspace.ucalgary.ca/jspui/bitstream/1880/43426/1/cavey%26cloney_1973.pdf

Wenn es Ihnen aber darum geht, bestimmte Strukturen zu sehen, dann eignen sich Fluoreszenzmethoden besser (Zellkerne: DAPI; Muskeln: Phalloidinkonjugat).

Michael Müller · Oktober 11, 2015, 18:52:10 NACHMITTAGS

Hallo Jon,
vielen Dank für Ihre Antwort.
Ich habe die bisherigen Antworten zum Anlass genommen, das Färbeprotokoll von H&E zu variieren.
Sie haben recht, bei einer längeren Überfärbung und Auswaschung scheint die Färbung mit Hämalaun zu klappen. Eine Differenzierung ist dann aber, wie Sie schreiben, notwendig. Diese habe ich bei meinen gestrigen Versuchen aber - noch - nicht durchgeführt.
Ich glaube aber, dass ich nun auf einem vernünftigen Weg bin. Sollte ich die nächsten Tage zu vorzeigbaren Ergebnissen kommen, werde ich diese hier posten.
Eine Verwendung von Osmiumtetraoxid kommt für mich als Amateur wohl nicht in Frage. Dazu fehlt mir die notwendige Laborausrüstung. Trotzdem vielen Dank für Ihre interessanten Links.

Beste Grüsse,

Michael

Bernhard Lebeda · Oktober 11, 2015, 19:10:35 NACHMITTAGS

Zitat von: Michael in Oktober 08, 2015, 10:25:18 VORMITTAG

Kennt jemand eine andere Übersichtsfärbung für Totalpräparate von Gastrotrichen / Rädertiere / Nematoden nach Formol-Fixierung?

Ich bin für jede Idee dankbar.

Hallo Michael

In "Die Bärtierchen" von Hartmut Greven ((Westarp 2004) S. 90 wird ein Färbeprotokoll mit Baumwollgrün angegeben. Ich wüsste allerdings nicht, ob man das noch bekommt. Bei Chroma hab ich es nicht gesehen.

Viele Mikrogrüße

Bernhard

Michael Müller · Oktober 14, 2015, 08:53:51 VORMITTAG

Hallo Bernhard,
danke für Deinen Hinweis auf Baumwollgrün. Leider finde ich weder im Web noch in alten Büchern eine Referenz auf Baumwollgrün. Vielleicht ist das eine alte Bezeichnung für einen heute noch gängigen Farbstoff? So wurde z.B. Metylblau früher wohl auch Baumwollblau genannt. Auch im Englischen ist die Bezeichnung "direct cotton dye" üblich.

Viele Grüsse,

Michael

Bernhard Lebeda · Oktober 14, 2015, 12:25:54 NACHMITTAGS

Zitat von: Michael in Oktober 14, 2015, 08:53:51 VORMITTAG
Hallo Bernhard,
danke für Deinen Hinweis auf Baumwollgrün. Leider finde ich weder im Web noch in alten Büchern eine Referenz auf Baumwollgrün. Vielleicht ist das eine alte Bezeichnung für einen heute noch gängigen Farbstoff? So wurde z.B. Metylblau früher wohl auch Baumwollblau genannt. Auch im Englischen ist die Bezeichnung "direct cotton dye" üblich.

Viele Grüsse,

Michael

Das ist ein interessanter Aspekt, das könnte natürlich Methylgrün sein.( das sollte mich wundern, wenn das hier in der Runde niemand wüsste!!) Das gibt es bei Chroma, das hab ich sogar hier!

Übrigens gibt es für Nematoden in "Fadenwürmer" von Arwed H. Meyl (grüne Kosmosreihe) ein Färbeprotokoll mit Baumwollblau. Dabei werden die fixierten Tiere in Lactophenol gebracht, das Baumwollblau (0,01%!!) ins Lactophenol gebracht und das ganze auf 60-65° erwärmt. (Stark verkürzt-ich kann Dir die Protokolle als Scans gerne zukommen lassen.)

Möglicherweise lohnt sich auch bei Gastrotrichen ein Versuch.

Viele gastrotriche Mikrogrüße

Bernhard