Liebe Mikroskopiker,
zur Zeit übe ich mich an Tangentialschnitten von Kiefernholz (Pinus sylvestris).
Das Holz verwende ich direkt frisch aus dem Wald. Geschnitten wird entweder mit Tischmikrotom oder manuell mit Rasierklinge. Die Schnitte werden zum Färben direkt in Etzold-FCA überführt.
Nach dem fünfminütigen Einfärben werden sie kurz in dest. Wasser geschwenkt und in Wasser unter dem Mikroskop begutachtet.
Und hier tritt auch schon das Problem auf: Der blaue Farbanteil fießt aus den parenchymatischen Markstrahlzellen aus, siehe Fotos. So etwas habe ich bei anderen Holzarten (z.B. Abies alba) noch nie erlebt, da bleibt das Astrablau schön in den Zellen.
Auch wenn ich nach dem Einfärben direkt mit Isopropanol entwässere, fließt das Blau aus.
Was mache ich falsch? Jeder Tipp ist willkommen!
Herzliche Grüße
Bernd
Meine Ausrüstung:
Kleines Tischmikrotom von Kosmos
Olympus-BHS
Canon EOS 600D
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186316_29356298.jpg)[/URL][/img]
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186316_45965037.jpg)[/URL][/img]
Pardon,
hier nochmal ein Versuch, die zugehörigen Bilder einzubinden:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186317_55160772.jpg) (http://s650.photobucket.com/user/miggeli1/media/Holz/Pinus-T%20FCA-Chroma_a_zps4ks4qbxe.jpg.html)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186317_66315655.jpg) (http://s650.photobucket.com/user/miggeli1/media/Holz/Pinus-T%20FCA-Chroma_Detail_zpspjtyiunj.jpg.html)
hallo Bernd
verfahre doch einmal genau nach folgender Vorschrift , wobei Pkt 1 natürlich entfällt :
http://www.aeisner.de/methoden/farb70.html
Das Pkt 7 verwendete Isopropanal muss unbedingt das wasserfreie I. sein
Hallo Bernd,
vielleicht liegt es daran, dass du Frischmaterial verwendet hast. versuche mal die Schnitte zu fixieren. Wenn du kein AFE hast könnte auch Ethanol alleine schon helfen. Danach wässern und färben wie gehabt.
Gutes Gelingen!
Hallo Wolfgang und Klaus,
vielen Dank für eure Vorschläge!
Bevor ich sie ausprobiere, habe ich auf die Schnelle noch einen anderen Versuch zwischengeschoben, und zwar die vorgeschnittenen Holzklötzchen vor dem Einfärben für zwei Stunden in Salzwasser gekocht. Vor vielen Jahren hatte ich an einem Holzbestimmungskurs teilgenommen, bei dem der Referent genauso vorgegangen war. Soviel ich weiß, sollte dadurch den Holzzellen das Wasser entzogen werden. - Hier das Ergebnis, mit dem ich erst einmal hochzufrieden bin:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186327_62249371.jpg) (http://s650.photobucket.com/user/miggeli1/media/Holz/Pinus-T_fuumlr%20mikroskopie-Forum_zpsc3dxbfw9.jpg.html)
Herzliche Grüße
Bernd
Zitat von: Bernd Miggel in Januar 13, 2016, 13:10:39 NACHMITTAGS
Liebe Mikroskopiker,
zur Zeit übe ich mich an Tangentialschnitten von Kiefernholz (Pinus sylvestris).
Das Holz verwende ich direkt frisch aus dem Wald. Geschnitten wird entweder mit Tischmikrotom oder manuell mit Rasierklinge. Die Schnitte werden zum Färben direkt in Etzold-FCA überführt.
Nach dem fünfminütigen Einfärben werden sie kurz in dest. Wasser geschwenkt und in Wasser unter dem Mikroskop begutachtet.
Und hier tritt auch schon das Problem auf:
Der blaue Farbanteil fießt aus den parenchymatischen Markstrahlzellen aus, siehe Fotos. So etwas habe ich bei anderen Holzarten (z.B. Abies alba) noch nie erlebt, da bleibt das Astrablau schön in den Zellen.
Auch wenn ich nach dem Einfärben direkt mit Isopropanol entwässere, fließt das Blau aus.
Hallo Bernd Miggel!
Selbstverständlich fließt das Astrablau aus, dieser Farbstoff überfärbt immer, deshalb darf man die
vier Alkoholstufen inkl. Differenzierung nicht einfach weglassen! Die Folge sieht man bei Ihren Schnitten: Astrablau ist mächtig
überfärbt - sowohl bei den beiden ersten als auch bei dem zuletzt gefärbten Schnitt.
Zu Ihrer Bemerkung, bei anderen Holzarten bliebe "das Astrablau schön in den Zellen", wäre noch zu bemerken: Das
Astraublau ist niemals
in den Zellen, denn es färbt wie alle anderen Farbstoffe auch, nur die Zell
wände an.
In den Zellen befindet sich nichts, was sich anfärben ließe, die sind leer! Beim Tangentialschnitt sieht man das gut, weil die Zellwände der dünnen Holzstrahlen wegen des geringen Lumens so nahe beieinander liegen, daß sie sich zu einem tiefblauen Farbklecks verdichten. Das Blau sollte schwächer sein, eher blaß, damit man bei höherer Vergrößerung besser in die Zellen hinein und hindurch sehen kann. Dieses Ergebnis erzielt man durch die Differenzierung: Dosiertes Auswaschen mit Alk. Isopropylalkohol ist vorteilhaft. Ethanol muß nicht sein.
Fragen Sie bitte nach, wenn noch etwas unklar sein sollte.
Viel Erfolg!
KH
Hallo Herr Henkel,
mir sind die vier Alkoholstufen leider nicht klar. Würden Sie mir diese Schritte bitte im Detail erklären, damit ich das ein für alle Mal richtig mache?
Herzlichen Dank!
Bernd Miggel
hallo bernd
beim Mikroskopie-kollegium Bonn gibt es eine diesbezügliche Anleitung :
http://www.mikroskopie-bonn.de/_downloads/Arbeitsplan_Etzold_FCA.pdf
Hallo Wolfgang,
danke für den Tipp! Aber von Differenzieren steht in dem Arbeitsplan nichts, oder habe ich das übersehen?
Viele Grüße
Bernd
hallo Bernd
mit dem Begriff "Differenzieren" im Sinne einer Präparateherstellung hatte ich anfänglich auch Verständnisprobleme. Bei solchen Färbetechniken versteht man unter differenzieren die Kontrolle des Verhaltens der einzelnen Farbkomponenten beim Einwirken der versch. Lösungsmiitel auf den Gehalt der Einzelfarbstoffe. Man wägt halt ab, ob genügend des Farbstoffes "herausgezogen" ist - eine Erfahrungstatsache.
ZitatAber von Differenzieren steht in dem Arbeitsplan nichts, oder habe ich das übersehen?
Hast du nicht lieber Bernd! Aber sonst ist die Arbeitsanleitung gut beschrieben.
Wenn du die gefärbten Schnitte nach dem Auswaschen in dest. Wasser unterm Mikroskop überprüfst und solche Überfärbungen feststellst, dann ist differenzieren angesagt. Dazu nehme ich 70%iges Ethanol und beobachte unter dem Stereomikroskop wenn möglich im Durchlicht den Fortschritt der Entfärbung. Kitzlige Sache, es ist schnell mal zu viel entfärbt mit geringeren Alkoholkonzentrationen geht es langsamer. Wenn der richtige Punkt erreicht ist sofort abstoppen in Wasser und dann die Eindekprozedur wie gehabt. Blöd ist, dass sich oft das Rot schneller verabschiedet, als das Blau.
Hallo Bernd!
Ich hätte da 2 Fragen an dich:
welche Konzentration hat die Salzlösung, in der du die vorgeschnittenen Holzklötzchen vor dem Einfärben für zwei Stunden kochst und
wie gross sind deine Holzklötzchen?
Liebe Grüße
Franz
Hallo Bernd,
Zitatvorgeschnittenen Holzklötzchen vor dem Einfärben für zwei Stunden in Salzwasser gekocht. Vor vielen Jahren hatte ich an einem Holzbestimmungskurs teilgenommen, bei dem der Referent genauso vorgegangen war.
Kann es sein, dass das mehrstündige Kochen eigentlich zum
Erweichen trockener Holzproben diente? Das macht man zumindest so, um alten Holzproben (Restaurationsaufgaben) überhaupt einen einigermaßen sauberen Schnitt abgewinnen zu können, wobei eine Färbung zur Bestimmung i.d.R. nicht notwendig ist. Ein sehr schönes Buch zu diesem Thema:
D.GROSSER: Die Hölzer Mitteleuropas - Ein mikrophotografischer Lehratlas (http://www.amazon.de/Die-H%C3%B6lzer-Mitteleuropas-mikrophotographischer-Lehratlas/dp/3935638221/ref=pd_sim_sbs_14_1?ie=UTF8&dpID=61YQ9Q0E0QL&dpSrc=sims&preST=_AC_UL160_SR121%2C160_&refRID=0GHKAVTQPMG2SQKFEG78) - Riprint der Originalausgabe von 1977 (ehem. Springer-Verlag). Die drucktechnisch und von den Fotos her wesentlich bessere Originalausgabe (http://www.amazon.de/Die-H%C3%B6lzer-Mitteleuropas-mikrophotographischer-Lehratlas/dp/3540080961/ref=sr_1_fkmr0_1?ie=UTF8&qid=1452787409&sr=8-1-fkmr0&keywords=D.GROSSER%3A+Die+H%C3%B6lzer+Mitteleuropas+-+Ein+mikrophotografischer+Lehratlas) ist leider nur noch total überteuert zu bekommen.
Grosser empfiehlt allerdings das Kochen in Wasser oder in einem Grycerin-Wassergemisch zur Erweichung. Hier geht es also genau um das Gegenteil: Hier soll Wasser reingebracht werden.
Habt Ihr denn damals bei dem Bestimmungskurs auch gefärbt?
Nachdenkliche Grüße
Gerd
Hallo Franz,
ein Teelöffel Kochsalz auf einen halben Liter Wasser. Aber bitte: Die Hintergründe für das Kochen in Salzwasser kenne ich nicht wirklich.
Die Klötzchen sind Stifte von 20 mm Länge und 10x10 mm Querschnittsfläche. So kann man sie bequem in das Tischmikrotom spannen oder von Hand mit Rasierklinge schneiden. Geschnitten wird die Querschnittsfläche, für jede Schnittebene also ein Klötzchen.
Das nachfolgende Foto zeigt einen Tangentialschnitt von Pinus sylvestris. Arbeitsschritte: Gefärbt fünf Minuten mit Etzold-FCA (Fa. Chemlab) mit kurzzeitigem Erhitzen, zweimal in Wasser gespült, differenziert zwei Minuten in Ethanol 70%, entwässert in drei Stufen mit Isopropanol 100%, eingebettet in Euparal. Mir scheint das Präparat immer noch etwas überfärbt, vor allem das Blau!
Herzliche Grüße
Bernd
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186381_39220779.jpg) (http://s650.photobucket.com/user/miggeli1/media/Holz/Pinus-T_fuumlr%20Forum_zpsab6nwma4.jpg.html)
Hallo Gerd,
das von dir angegebene Buch besitze ich selber, wirklich lesenswert!
Damals im Holzbestimmungskurs haben wir mit Toluidinblau gefärbt. Dauerpräparate sind damit auch möglich. Die Färbung nach Etzold gefällt mir allerdings wesentlich besser.
Herzliche Grüße
Bernd
Hallo Bernd!
Danke für das Rezept!
Ich möchte dir zum Vergleich den tangentialen Schnitt eines Sprosses auch von Pinus sylvestris zeigen, der allerdings mit W3A gefärbt wurde. Die Rezeptur ist auch auf der berühmten Bonner Seite zu finden.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186387_20104623.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
Liebe Grüße
Franz
Hallo Franz,
danke für das Schnittfoto, W3A als Färbung ist vorgemerkt!
Herzliche Grüße
Bernd
Hallo Franz,
sieht sehr schön aus! Kannst Du bitte mal etwas dazu sagen, was die Farben bedeuten! Speziell würde mich interessieren, wie die beiden gelb-orangen Streifen zu Stande kommen.
Beste Grüße
Gerd
Hallo Franz,
das Foto ist einfach genial ! Danke fürs Zeigen.
Gruß !
JB
Hallo Gerd!
Der Strasburger bietet, aus meiner Sicht, mehrere Deutungsmöglichkeiten, die sind mir aber zu spekulativ, deshalb nur ein Bild aus dem Strasburger, das aber auch nicht wirklich die Streifen erklärt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186413_43890719.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
M ist das Rindenstrahlparenchym.
Ich habe auch noch die Fluoreszenzaufahme gefunden, radialer Schnitt W3A bei 405nm zum Vergleich.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/186413_28925319.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
Liebe Grüße
Franz
PS: das Fluoreszenzbild der Kiefer ist beim Hochladen pixelig geworden und ich weiss nicht warum.....
Hallo Franz,
vielleicht ist es auch nur ein etwas unegales Aufziehen der Farbe. Ich hatte das auch schon bei Holzschnitten. Geht dann beim Differenzieren weg.
Anders ist es bei Druck und Zug-Bereichen, aber die sind dann eindeutig lokalisiert und kommen nicht streifenfürmg vor.
Hallo Klaus!
Ja, könnte sein! Andererseits zeigen auch meine anderen Schnitte der Kiefer dieses Phänomen - ich weiss nicht, vielleicht wirklich zu wenig differenziert.
Liebe Grüße
Franz
Hallo Franz,
mein erster Gedanke zu den Streifen war, dass das vielleicht doch schon angeschnittene Jahresringe sind weit es vielleicht ein sehr kleines Stamm- oder Aststück war und es zum Rand hin nicht mehr richtig "tangential". Mir scheinen auch die Holzstrahlen zum Rand hin breiter weil vielleicht schon etwas schräg geschnitten.
Beste Grüße
Gerd
Hallo Gerd!
Ich kann mich erinnern, dass der Spross ein Ø von ca. 4mm hatte - vielleicht such ich am Wochenende die Präparate.
In dem Fluobild sind die Streifen auch zu erkennen - ich sollte es nochmals bereits richtig verkleinert hochladen.
Liebe Grüße
Franz
Liebe Mikroskopiker,
meine letzten Schnitte (Pinus, Picea) habe ich nach dem Einfärben (5 Min. Etzold-FCA) und Auswaschen mit Ethanol 70% differenziert, hat gut funktioniert.
Jetzt möchte ich aber mal mit Isopropylalkohol differenzieren. Wie kann ich dabei praktisch vorgehen, muss das "Iso" zum Differenzieren herunterverdünnt werden?
Vielen Danke im Voraus!
Herzliche Grüße
Bernd
Hallo Bernd,
das ist ganz einfach. Nehmen wir an, Du kommst nach der Etzold Färbung aus Wässriger Lösung und möchtest in Euparal eindecken. Dazu spülst Du mehrfach mit reinem Isopropanol, um die Schnitte zu entwässern und kannst dann direkt eindecken, da Isopropanol das Intermedium für Euparal ist.
Normalerweise versuchst Du vor dem Aufbringen des Isopropanols das letzte Wasser der Spülung so gut wie möglich abzusaugen und wechselst das Isopropanol über den Schnitten dann mehrfach schnell aus, um den Wasseranteil so schnell wie möglich zu verringern und so ungewolltes Differenzieren zu vermeiden. Genau da liegt der Schlüssel:
Sauge das Wasser nur unvollständig ab und gebe Isopropanol dazu (in etwa 3:7 oder nach Gefühl). Beobachte dann das Abgehen der roten Farbstoffwolken und beende die Differenzierung wenn Du Dein ziel erreicht hast wie oben beschrieben mit reinem Isopropanol im schnellen Wechsel.
Ach ja: meine Beschreibung geht davon aus, dass die Schnitte in z.B. einem Uhrglas bleiben und die Reagenzien nach Rezept zugegeben und wieder abgesaugt werden. Dies hat den Vorteil, dass man mehrere Schnitte "gleichzeitig" bearbeiten kann. Das ganze geht natürlich auch, in dem man die Schnitte z.B. per Pinsel in die jeweilige Lösung überführt. Hier sehe ich zwei Nachteile: mit dem Pinsel werden immer Teile der vorherigen Lösung verschleppt, was besonders beim Entwässern problematisch sein kann und wenn Du mehrere Schnitte bearbeitest, lassen sich die Zeiten schwieriger steuern.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Jörg,
vielen Dank!! - Dann kann's ja losgehen.
Herzliche Grüße
Bernd