Hallo Forum,
ich versuche gerade Paraffinschnitte zu verarbeiten. habe eine größere Anzahl von Paraffinblöcken mit Zoo-und botanischen Präparaten zur Verfügung, die ich vor Jahren von einer Schule für Medizinpersonal geschenkt bekam. Abgebildet ist ein erster Versuch eines mir unbekannten botanischen Präparates, geschnitten mit einem Schlittenmikrotom, eingestellt auf 15My. Den Schnitt habe ich in ein Streckbad mit 50°C verbracht und mit einem OT herausgefischt. Die weitere Verarbeitung geschah mit der Auftropfmethode, Entparaffinierung mit Rotihistol. Absteigende Alkoholreihe nach Vorschlag der Fa Roth, Färbung Mit meinem Spezialgemisch(siehe unten) und Aufsteigende Alkoholreihe (Isopropanol-Rotihistol) wieder nach Roth. Eindeckung mit Entellan.
Mir geht es dabei erst einmal um das Schneiden und das Handling der Verarbeitung zu üben. Um überhaupt eine Farbe einzubringen habe ich aus Fuchsin-Pulver und Mettylenblau flüssig ein Gemisch gebraut und auf gut Glück 5 Min. einwirken lassen. Obwohl sich im Laufe der Jahre ein beachtliches Arsenal an Farben bei mir angesammelt hat, bin ich noch ziemlich ratlos, wie ich diese am besten anwenden könnte. Für Ratschläge wäre ich sehr dankbar.
Das Bild zeigt nun so einen ersten Versuchsschnitt noch nicht mit Photoshop geputzt, um eine konstruktive Kritik zu ermöglichen, um die ich hier die Experten des Forums ersuche.
Schöne Grüße
Gernot
Hallo Gernot,
sieht doch gelungen aus. Vielleicht etwas zu dünn für den Anfang, bei 20µ würde er vielleicht weniger einreißen.. Wenn du so eine große Farbsammlung hast dann könntest du vielleicht Etzold blau mixen, das wäre sinnvoll und attraktiv und einfach anzuwenden. Ist sicher ein Lippenblütler Taubnessel, Lavendel und ....
Herstellungsvorschrift im Kremer Kosmos Großes Buch der Mikroskopie Im Zweifel bei mir fertig gemixt.
Guten Morgen Gernot
Mit welchem Mikrotom(Typ) und welchem Messer(Typ) hast Du denn geschnitten? Da Du Ausrisse hast sind das wichtige Eckpunkte ...
Liebe Grüße
Gerhard
Hallo Gernot,
nach einer Nacht schlafen fällt mir ein: eigentlich müsste das Xylem rot sein? Ist es wahrscheinlich auch, aber bei der niedrigen Kondensorapertur säuft die Farbe ab. Zeig mal bitte einen Eckenausschnitt mit dem 10er Objektiv
Hallo Gernot,
ich bin zwar absolut kein Spezialist auf diesem Gebiet, da ich eher aus der Tümpler-Ecke komme, aber aus meiner Zeit als Schüler und als damaliger Besitzer eines "Kosmos-Mikroskopiekastens" kann ich mich noch an die Astrablau-Safraninfärbung erinnern, die ich auch damals mit Erfolg angewandt habe. Bei meinen Recherchen bin ich dann noch auf folgenden Link gestossen: http://www.aeisner.de/methoden/farb1.html (http://www.aeisner.de/methoden/farb1.html). Vielleicht hilft Dir das ja ein wenig. Deine "Schnitterstversuche" finde ich für den Anfang schon gut gelungen.
Hallo,
Danke für die Antworten.
@Klaus: Danke für die Tipps. Nach welchem Rezept bekommt man Etzold Blau? Ich habe zwar 24 verschiedene Färbemittel, die meisten in flüssiger Form, einige in Pulverform. Aber wenn ich ein bestimmtes Rezept verwirklichen will fehlt doch immer wieder das eine oder andere (aktuell zB. Crysoidin). Außerdem sind alle schon ziemlich betagt. Wie lange halten diese Reagenzien eigentlich?
Hier ein Bild eines Eckausschnittes aufgenommen mit dem Apochromat 12,5x0,35 oo/0,17-A Tubuslinse 0,8x geblitzt.
@Gerhard: Das Mikrotom ist ein Schlittenmikrotom Jung Heidelberg mit einem c-Messer.
@Michael: Danke für den Link, werde ich bei nächster Gelegenheit probieren.
Ich habe den Verdacht, dass die Risse davon kommen, weil ich die größten Probleme beim Auflegen des Deckglases habe. Immer wieder verrutscht es, wenn ich z.B. die empfohlene M8-Mutter drauflege. Beim nächsten Durchgang mache ich eine mikroskopische Zwischwnkontrolle, gleich wenn sich das Paraffin verzogen hat.
Liebe Grüße
Gernot
Hallo Gernot, na sage ich doch die Färbung ist gut gelungen, es lag nur am Foto.
Ich verwende einen speziellen Kondensor für große Gesichtsfelder, damit leuchtet man gut aus und hat trotzdem genügend Licht, dass die Farben nicht ins graue abdriften.
Zu den Farbrezepturen bzw Reagenzien schreibst du mir am Besten eine Mail.
Feststoffe halten sich oft sehr lange, Lösungen kann man nach längerer Zeit (einige Monate) durch filtrieren oft wieder gebrauchstüchtig machen.
Hallo Gernot,
die Risse treten vor allem an den äußeren Rändern des Xylems auf. Ich tippe daher auf eine unterschiedliche Ausdehnung der unterschiedlichen Strukturen bei einem der Prozessschritte. Die Paraffinsorte kennen wir leider nicht? Möglicherweise wird der Schnitt im Wasserbad zu sehr gestreckt, schwimmt ein wenig zu viel auseinander. Ich würde daher versuchen, die Temperatur des Wasserbades ein wenig herunter zu setzen, z.B. auf 47 Grad. Auch die ,,Auftropfmethode" kommt als Ursache in Betracht. Kannst Du den OT nicht kommplett in ein kleines Gläschen stellen? Die Risse könnten natürlich auch an der Einbettung liegen die wir ebenfalls nicht kennen.
Viel Erfolg
Jürgen
Hallo Jürgen,
Das Parrafin kenne ich leider nicht. Aber die Blöcke stammen von einer Schule für medizinisches Personal. Ich gehe davon aus, dass die ein anständiges Material verwenden. Ich habe noch einige Schnitte gemacht und in 47° Wasser gestreckt, dann einen Teil auf einem kleinen Leitz Gefriermikrotom und den anderen Teil auf dem Schlittenmikrotom geschnitten. Beim Gefriermikrotom bewegt sich das Messer auf einer Kreisbahn. Alles mit 15My. Morgen schneide ich noch einmal mit 25My und morgen verarbeite ich sie auch weiter. Ich werde auch jeden Arbeitsschritt unter dem Mikroskop prüfen und fotografieren. Ich glaube, dass man schon jetzt einen unterschied zwischen den Mikrotomen erkennen kann (siehe Fotos der rohen Schnitte Bild 1 Gefriermikrotom, Bild2 Schlittenmikrotom).
Die Methode in kleinen Behältern habe ich schon versucht, da schwimmen mir aber zu viele Proben weg.
Eingebettet habe ich in Rotikitt und in Entellan.
Schöne Grüße
Gernot
Moin,
Ist 75Grad nicht zu hoch..?ich dachte immer im Streckbad darf das Paraffin nicht schmelzen,um die Schnitte dadurch nicht zuzerreißen?Sollte man nicht immer so um die 5-7 Grad unter der Schmelztemperatur bleiben?
Mit freundlichen Grüßen Jörg
Hallo Jörg,
Danke für den Hinweis, ich hab mich verschrieben es sind 47°C. Hab es auch schon ausgebessert.
LG
Gernot
Lieber Gernot,
bitte beschreibe doch einmal Deine Prozessschritte etwas genauer. Bei welcher Temperatur schneidest Du mit welchem Messer, mit welchem Winkel? Klebst Du die Schnitte auf? Womit? Nur mit Wasser? Wie trocknest Du den Schnitt? benutzt Du eine Wärmeplatte?
Kennst Du das hier?
https://www.leicabiosystems.com/fileadmin/academy/2011/Microtomy_booklet_english_online.pdf (https://www.leicabiosystems.com/fileadmin/academy/2011/Microtomy_booklet_english_online.pdf)
25 mü? Wozu dann Paraffin?
Schöne Grüße
Jürgen
Lieber Jürgen,
Zur Beschreibung der derzeit aktuellen Prozessschritte:
Schneiden auf dem Jung Schlittenmikrotom bei Zimmertemperatur von dzt. 20,7°C. Messer ist ein Jung b, obere Fläche leicht konkav, abgezogen auf Belgischem Broken und Biber-Lederstreichriemen. Den Freiwinkel habe ich durch Probieren ermittelt, (bis die Schnitte nicht mehr aufrollen). Die Schnitte werden mirt einem Pinsel Nr2 abgenommen und in das Streckbad mit 47°C überführt. Die gestreckten Schnitte fische ich mit einem gereinigten OT aus dem Bad und stelle sie schräg auf einer saugfähigen Unterlage mit dem Rücken an die Wand. Dann kommen die OT auf die Wärmeplatte mit kurzzeitig 50,5°C und bleiben dann bei 45,5°C über Nacht auf der Platte, abgedeckt mit einem Pappkarton. Die getrockneten OT weden dann in Transportbehältern bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt.
Die weitere Verarbeitung erfolgt nach Empfehlung der Fa. Carl Roth GmbH+Co.Kg:
Die Reagenzien werden mit Pipette aufgetropft und nach der Einwirkzeit durch Senkrechtstellen zum Ablaufen gebracht. Roth empfiehlt Ethanol, ich verwende aber 2-Propanol, weil ich da die ganze Reihe schon vorbereitet habe.
3x10 min Roti-Histol; 2x5 min 2-Propanol 99,5%; 2x5min 2-Propanol 95%; 2x5min 2-Propanol 80%; 2x5min 2-P 70%; 3x 5min Aqua dest.; 1x5min Etzold Färbegemisch; Spülen mit Aqua-dest.; 1x 5min 2-P 70%; 1x5min 2-P 80%; 1x5min 2-P 95%; 1x5min 2-P99,5%; 2x5min Roti-Histol; Grobe Reste von R-H werden vorsichtig abgetupft, ein kleiner Tropfen Eindeckmittel mit einem Glasstab aufgebracht und dann ein rundes Deckglas mit einer feine Pinzette laaangsam aufgelegt. als Eindeckmittel habe ich früher Roti-Histokitt genommen, das ist aber ziemlich dickflüssig und ich hatte damit Probleme mit Luftblasen. Jetzt nehme ich Entellan. Das ist dünnflüssiger und wird trotzdem schnell fest. Jetzt kommen die OT wieder auf die Wärmeplatte bei 45°C bis das Einschlussmittel fest ist.
Das ist also die ganze Prozedur im Detail.
25mü bzw. 20 mü möchte ich versuchen, weil mir das Klaus Herrmann vorgeschlagen hat. Paraffinschnitte mache ich deshalb, weil ich seit langem 30 Paraffinblöckchen und 3 Mikrotome besitze und ich endlich einmal dieses Handwerk erlernen möchte.
Danke für den super Link, den kannte ich noch nicht, Ist sicher eine interessante Sache für und von Profis, die man eben dann auf die bescheidenen Möglichkeiten eines Hobbymikroskopikers transformieren muß.
Liebe Grüße
Gernot
Hallo Gernot,
vielen Dank, dass Du uns an Deiner Entwicklung teilhaben lässt! Paraffinschnitt möchte ich irgendwann auch noch mal in Angriff nehmen, und so folge ich Deinem Fortschritt mit großem Interesse.
Viele Grüße,
Bob
Lieber Gernot,
ich vermute, Du hast den letzten Schnitt von links nach rechts geschnitten? Vielleicht versuchst Du einmal, Deinen Block ein wenig zu kühlen. Wahrscheinlich ist Dein Block auf eine Holzunterlage aufgeklebt? Dann würde ich ihn für einige Minuten in den Kühlschrank tun. Vermutlich ist es dann schwer, den Block wieder reproduzierbar in die Klammer des Mikrotoms einzuspannen. Falls Du ihn auf einer der Einbettkassetten hast, wäre es einfacher: Du könntest die Kassette in kaltes Wasser schmeißen. Der Winkel beim Schneiden wird sich vermutlich ändern. Die Schnittstärke wirst Du dann reduzieren müssen. Wenn die Ursache Deiner Risse unterschiedlich schneidbares Material ist (dichteres Xylem) könntest Du Dir so vielleicht helfen.
Betrachte einmal Deinen Schnitt unmittelbar nach dem Fischen aus dem Wasserbad. Sind die Abrisse am Xylem da auch schon vorhanden?
Beim Trocken stellst Du Deinen OT kurz bei 50,5 Grad auf die Wärmeplatte.Fängt da Dein Paraffin schon an zu fließen oder wird der Schnitt maximal glasig oder verändert sich Dein Paraffinschnitt nicht?
Schöne Grüße
Jürgen
Lieber Jürgen,
danke für Deine Tipps. Ja, die Paraffinblöcke sind auf Holzklötzchen aufgeschmolzen. Über das Kühlen habe ich auch schon gelesen. aber wenn ich die Klötze aus dem Kühlschrank nehme und auf dem Mikrotom wieder einrichten muss sid sie zum Schneiden wieder warm. Da werde ich mir etwas einfallen lassen. Eventuell den Block am Mikrotom mit einem Eiswürfel kühlen?
Die letzten Bilder stellen die Schnitte unmittelbar nach dem Auffischen dar.
Beim Trocknen mit 50,5°C werden die Schnitte maximal glasig.
Bei meiner Beschreibung der Prozessschritte habe ich noch vergessen zu sagen, dass ich nach Aufbringen von 2-Propanol den Schnitt mit einem kleinen Hütchen abdecke, weil sonst das 2-Propanol zu schnell verdunsten würde. ( Kunststoffdöschen von der Hotelmarmrlade).
Schöne Grüße
Gernot
LieberGernot
als ich noch mit Holzklötzchen geschnitten habe, habe ich diese Klötzchen zweistufig zugeschnitten. Der schmalere Teil verschwand in der Klammer des Mikrotoms, der breitere Teil lag auf der Klammer auf. Damit ließe sich die Position des Klötzchens gut reproduzieren, na sagen wir mal einigermaßen. Das Kassetensystem war dann schon eine große Verbesserung.Vielleicht gehst Du zum Schneiden mal einfach in den kühlen Keller?
Eine Kühlung mit Eis führt natürlich dazu, dass das Holz nass wird und quillt. Solange sich der Paraffinblock dabei nicht löst, ist das bei Deiner Schnittstärke aber wohl gleichgültig.
Ich weißnicht wie schnell zu schneidest. Aaber Dein Problem könnte auch damit zusammenhängen, dass die Schnittgeschwindigkeit zu schnell ist.
Mit der Tropfmethode handelst Du Dir anscheinend Deinen Schmutz ein, der um Dein Objekt liegt.Vielleicht solltest Du doch überlegen, einen Kleber zum Kleben Deiner Schnitte zu verwenden.
Schöne Grüße
Jürgen
Lieber Jörg,
um eine Reproduktion und Kühlung zu ermöglichen habe ich mir ein Spezialklötzchen (Klotz) aus Aluminium gebastelt. Wegen der großen Masse hält es lange kühl, wenn es aus dem Kühlschrank kommt. Und es steht fest am Boden der Eispannvorrichtung des Mikrotoms.
Ich habe also mit 20Mü geschnitten, gekühlt geschnitten, alle möglichen Schnittgeschwindigkeiten probiert, verschiedene Schittwinkel probiert, Mit 47°C -Bad gestreckt, aber die Risse treten noch immer auf. Liegt es vielleicht am Messer? Sind Einmalklingen mit Klingenhalter besser geeignet? In der professionellen Mikroskopie sieht man nur solche, oder hat das andere Gründe? ich habe auch die Schnittfläche des Klötzchens im Auflichtmikroskop betrachtet. Da gibt es noch keine Risse. Diese entstehen also eindeutig beim Schneiden.
Schöne Grüße
Gernot
Lieber Gernot,
ZitatLiegt es vielleicht am Messer
Ich denke eher nicht. Ein wenig verwundert bin ich, dass Du für 20 mü ein B Messer benutzt. Aber wenn das nicht flattert, was Du an feinen Querrillen über der Blockoberfläche sehen würdest und es scharf ist,wird das Messer nicht die Ursache sein.
ZitatSind Einmalklingen mit Klingenhalter besser geeignet? In der professionellen Mikroskopie sieht man nur solche, oder hat das andere Gründe?
Die Stahlmesser muss man pflegen, abziehen und regelmäßig schleifen. Die Einmalmesser werden weggeschmissen, wenn sie nicht mehr benutzbar sind. Stahlmesser sind fantastisch, wenn man das Abziehen versteht.
Wenn ich Dein letztes Bild betrachte, habe ich etwas Zweifel daran, dass der Block in Ordnung ist. Die Stelle, an der das Objekt eingebettet ist, sieht völlig anders aus, als die Umgebung. Natürlich erkennst Du das Objekt im Block auch bei korrekter Einbettung. Aber bei korrekter Infiltration muss alles gleichmäßig! im Wachs liegen. Da dürfen keine milchig hellen oder leicht bröselig erscheinenden Stellen sein.
Kannst Du mal eine gute Auflichtaufnahme vom Block machen? Hast Du einen anderen Block für einen weiteren Versuch? Eventuell hilft, den Block mit dem Gesicht ein paar Minuten auf eine feuchte! Eisfläche zu legen oder ihn in ein Gefäß mit Eiswasser zu stellen. Wenn das Xylemgewebe überprozessiert ist, kannst Du Dir eventuell so helfen.
Jürgen
Gernot,
Leica hat auch ein Dokument erstellt, in dem die meisten Paraffinprobleme nicht nur beschrieben, sondern auch mit vielen Bildern erklärt werden". Es werden verschiedene Lösungen angeboten. Kann als pdf kostenlos heruntergeladen werden.
Link zu diesen Artikel ist: https://www.leicabiosystems.com/fileadmin/academy/2011/95.9890_Rev_A_Difficult_Blocks.pdf (https://www.leicabiosystems.com/fileadmin/academy/2011/95.9890_Rev_A_Difficult_Blocks.pdf)
Und denke daran das es viel Übung kostet um gute schnitte herzustellen und nur von viele Fehler kann man lernen.
Grüße Ronald
Hallo Gernot
Ich schneide Blöckchen auch mit dem B- Messer, diese müssen mit den passenden Abziehülsen so alle 30 bis Max 50 Schnitte neu abgezogen werden ...
Wenn Du das nicht machst bekommst Du schnell Probleme ...
Auch bei den Einmalklingenhalter gibt es viele unterschiedliche Typen, Feather und Leitz Microsystems sind die verbreitetsten. Alle Einmalklingenhalter sind nicht so scharf wie ein Ideal aufbereitetes B-Messer ...
Liebe Grüße
Gerhard
Hallo Jürgen,
hier ein Auflichtfoto vom Klötzchen. Ein anderer Block ist bereits in Bearbeitung. Ich habe jetzt auch den Anstellwinkel des Messers genau vermessen und kann dadurch den Freiwinkwl auf genau 3° einstellen. Und welch Überraschung, es kommen lauter gleichmäßige unaufgerollte oder gestauchte Schnitte daher.
Hallo Ronald,
danke für den super Link.
Hallo Gerhard,
viele Tips für die Mikrofotografie habe ich mir aus einem Buch von einem gewissen G. Zimmert geholt. Kennst Du den vielleicht? ;)
Lieber Gernot,
ich denke, dass damit die Hauptursache klar ist Der Block ist nicht gut infiltriert. Im Übrigen vibriert Dein Messer ganz fein. Das kann am zu steilen Freiwinkel liegen. Wenn das Photo aber nach einem Schnitt mit 3 Grad gemacht ist, scheidet der Winkel als Ursache aus. Sind Messer und Messerhalter wirklich festgeschraubt? Ist das Messer an einem Punkt oder an zwei Punkten befestigt? Was für ein Schlittenmikrotom hast Du? B Messer sind natürlich instabiler als C Messer und neigen daher zu Vibrationen, insbesondere, wenn Hartes dick geschnitten wird. B ist ein vorzügliches Messer, um Planzen frisch ziehend zu schneiden.
Kennst Du das hier?
http://www.klaus-henkel.de/cut-mikrotom.html (http://www.klaus-henkel.de/cut-mikrotom.html)
Schöne Grüße und viel Erfolg, ich bin gespannt auf den nächsten Block!
Jürgen
Guten Morgen zusammen,
ich habe mal ein grundsätzliche Frage: Bietet ein Schnitt aus Paraffineinbettung heraus bei diesem Objekt einen Vorteil gegenüber einem Schnitt frisch, z.B. einfach mit Handmikrotom und Klingenhalter? Es ist vermutlich eine geringere Schnittdicke möglich, aber stellt die einen Vorteil fürs Präparat dar? In Paraffin einbebettet könnte ich z.B. eine Blüte quer schneiden und hätte die Blütenblätter alle mit in Position im Präparat, was ohne Einbettung nicht gelingen würde. Aber bei so einem Stiel ist der Unterschied doch vermutlich gering?
Viele Grüße,
Bob
Hallo Bob,
Dass siehst Du richtig. Die Paraffineinbettung ist in der Botanik hauptsächlich dann notwendig, wenn Objekte beim Schneiden zerfallen und nicht an ihrer Position bleiben. Bei einem Pflanzenstengel ist der Aufwand viel zu groß und überflüssig. Man kann die Stängel auch so hinlänglich dünn schneiden. Zu dünne Pflanzenschnitte sind ohnehin meist nicht in der Lage beim Färben genügend Farbstoff anzulagern, um schöne Ergebnisse zu liefern. Aber das ist Geschmacksache🙂🔬
Ich wollte das Vorgehen auch nicht in Frage stellen, irgendein Objekt muss man ja nehmen, um das Verfahren zu erproben. Das Paraffineinbetten möchte ich auch irgendwann mal ausprobieren.
Zitat von: Gernot Armbruster in Oktober 17, 2018, 14:59:41 NACHMITTAGS
Sind Einmalklingen mit Klingenhalter besser geeignet? In der professionellen Mikroskopie sieht man nur solche, oder hat das andere Gründe?
Hallo Gernot,
ein Grund für die Verwendung von Einmalklingen ist, dass es mit festen Klingen zur Verschleppung von Material von einem Schnitt auf den Anderen kommt. Z. b. der Analyse von Tumorgewebe wird aus den Schnitten DNA isoliert um den Tumor molekulargenetisch zu charakterisieren. Die Methode (Next Generation Sequencing, PCR) ist so empfindlich, dass DNA aus vorangegangenen Schnitten das Ergebnis verfälscht.
Viele Grüsse,
Florian
Hallo Bob,
Einen Vorteil hat das Einbetten in Paraffin doch noch, auch für Stengel. Die Proben sind Jahrzehnte lagerfähig. Ich habe Paraffinblöcke die 30Jahre alt sind und immernoch brauchbar sind.
Hallo Harald,
das ist natürlich ein deutlicher Vorteil. Ich stelle für mich fest, dass ich mich den selben Objekten gerne wieder mit neuen Methoden zuwende.
Viele Grüße,
Bob
Hallo Bob,
hier ein sicherlich nicht perfekter Vergleich eines Paraffin-Schnittes mit einem in Möhre-eingebettet Schnittes.
Das Markparenchym des Triebes der Süßkartoffel Ipomoea batata läßt sich nur im Paraffin-Schnitt erhalten. (Bilder sind außer Stitch unbearbeitet)
ohne Paraffin:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/240387_27199126.jpg)
Mit Paraffin:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/240387_16001149.jpg)
Viele Grüße
Joachim
Lieber Jürgen,
da ist nun der nächste Block. Auf dem Holzklötzchen steht drauf:"Tulipa Fruchtknoten sp FPA, Ex, Butanol Rotiplast". Leider bekomme ich selbst mit dem 1,6x-Objektiv nicht die ganze Probe auf das Bild. Die Unreinheiten kommen von meinen uralten Objektträgern. Aber ich denke zum Üben und Lernen sind sie noch zu gebrauchen. Wenn es "ernst" wird muss ich mir onehin neue beschaffen. welche sind denn für den Hobbymikroskopierer empfehlenswert?
Das Mikrotom ist von R.Jung Heidelberg, mit der Fabriknummer 40291. Mehr steht nicht drauf. Das ganze Gerät wiegt 25Kg. Das Messer ist mit 2 Schrauben fest eingespannt. Es ist alles sehr massiv gebaut.
Danke für den Link von K. Henkel, bin schon beim Lesen.
Schöne Grüße
Gernot
Hallo Gernot,
wenn du weiter so gute Schnitte machst solltest du mal in Erwägung ziehen die OT vorher zu putzen. Ich mach das immer mit etwas ATA auf Daumen und Zeigefinger. Damit putze ich den angefeuchteten OT und spüle danach gut ab. Wirkt Wunder! Wenn man Serien verarbeitet sind frische wirklich saubere etwas Zeit sparender.
Na also, lieber Gernot!
Da kannst Du langsam daran denken, bei Klaus eine vernünftige Farbmischung zu kaufen, und soweit noch nicht vorhanden, alles zum selbst Einbetten, dann wirds noch besser.
Erster Schritt wäre allerdings, mit sauberen OTs zu arbeiten. Ich schwöre für meine Zwecke auf Knittel, aber ich denke, die Wahl der OTs ist nicht so entscheidend, sie sollten allerdings bei Dir schon sauber ankommen. Auch dann ist reinigen unerlässlich, im Forum gibt es dutzende Arbeitsanweisungen hierfür.
Wenn Klaus hierfür - ernsthaft, lieber Klaus, Ata? nee, also wirklich - ein Scheuersandmittel vorschlägt, kannst Du mal sehen, was er von Deinen OTs hält.
Du wirst schon sehen: Wenns nicht sauber ist, hundertprozentig, auch bei den Flüssigkeiten (Filtern), liegt immer irgendwo ein Flusel, und zwar immer! an der im Übrigen schönsten Stelle im Schnitt. Wie hier auch.....
Weiterhin viel Erfolg!
Jürgen
ZitatWenn Klaus hierfür - ernsthaft, lieber Klaus, Ata? nee, also wirklich - ein Scheuersandmittel vorschlägt, kannst Du mal sehen, was er von Deinen OTs hält.
Im Ernst liebr Jürgen. Der "Scheuersand" ist ja nicht so hart wie Glas. Ich habe noch nie einen OT damit verkratzt, aber wenn sie so richtig verranzt sind ("geputzt, gebrauchsfertig" :o ) dann geht es damit am schnellsten.
ZitatDa kannst Du langsam daran denken, bei Klaus eine vernünftige Farbmischung zu kaufen
Das kann ich seit heute mit noch besserem Gewissen nur empfehlen. Mein neuer Etzold Blau Ansatz ist sehr gelungen und nachdem ich für viel Geld neues Alcianblau gekauft habe ist Wacker ASim II jetzt wieder eine Pracht.
Ich hatte einen Ansatz Alcian Blau von Fluka "für Mikroskopie" der nach Stehen wieder ausgeflockt ist und praktisch nicht gefärbt hat. Ich habe es erst durch eine Reklamation gemerkt. Beim Dörnbertreffen habe einige von diesem Ansatz gekauft. Ich bitte um Verzeihung, ich werde Ersatz liefern!
Zitat von: Klaus Herrmann in Oktober 21, 2018, 10:43:15 VORMITTAG
wenn du weiter so gute Schnitte machst solltest du mal in Erwägung ziehen die OT vorher zu putzen. Ich mach das immer mit etwas ATA auf Daumen und Zeigefinger. Damit putze ich den angefeuchteten OT und spüle danach gut ab. Wirkt Wunder! Wenn man Serien verarbeitet sind frische wirklich saubere etwas Zeit sparender.
Hallo Klaus,
das habe ich sofort probiert und es funktioniert wirklich. abgewischt habe ich mit "Whatman Lens cleaning Tissue" , das erste Tuch, das ich in Händen habe, das nicht fusselt!
Schöne Grüße
Gernot
Zitat von: Jürgen H. in Oktober 21, 2018, 12:15:00 NACHMITTAGS
Na also, lieber Gernot!
Ja es freut mich auch, dass es doch gelungen ist, dank Deiner und Eurer Hilfe in diesem super Forum. Wegen der Färberei bin ich mit Klaus schon in Kontakt getreten.
Liebe Grüße
Gernot
Hallo Experten,
nun geht es weiter mit den Färbemitteln von Klaus Herrmann, die ich jetzt zur Verfügung habe, und hoffe wieder auf Eure geschätzte Fachkritik.
Bild 1 ist wieder eine Tulpia sp Fruchtknoten, Etzold ohne Differenzierung.
Bild 2 das selbe mit 70% Etanol Differenzierung. Nach einigen Sekunden war alles Rot verschwunden.
Bild 3 Adlerfarn, Wacker A Sim II
Bild 4 das selbe als Ausschnitt.
Astralblau-Safranin habe ich auch probiert, ist aber komplett daneben gegangen. (Geschätzte 1000Luftblasen). ist schon in der Tonne.
Zwei neue Lehren habe ich dabei erfahren, 1) alle OT werden mit einer dünnen Schicht Krauter`s Glyzerin Gelatine überzogen, und 2) das Deckglas wird nach Methode R.Wacker aufgelegt: Auf das Deckglas kommt ein Tropfen Euparal, darauf kommt der OT mit dem Schnitt nach unten und alles wird schnell umgedreht, DG nach oben.
Ich würde gerne den Text zu den jeweils zugehörigen Bildern schreiben aber wie geht das?
Die Bilder 3 und 4 muß ich extra eingeben, waren zu groß. Auch das werde ich noch lernen!
Lieber Gernot,
zunächst einen Glückwunsch zu den wesentlich verbesserten Schnitten.
Zu den Färbungen der pflanzlichen Mikrotechnik kann ich leider kaum etwas beitragen. Die Färberei ist im Übrigen, wenn man es genau machen will, recht komplex: Fixiermittel, Fixierzeit, Einbettung, Schnittdicke, Färbezeit, pH Wert und maches mehr spielt eine Rolle. Leider kennst Du ja die Fixierung nicht. Aber Dein Vorgehen bei der Färbung könntest Du einmal genau darstellen, so blass dürfte ein 20 müSchnitt nicht daherkommen. Dann wird Dir sicher jemand aus dem Forum weiterhelfen können.
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Gernot,
mein Kommentar als nicht-Fachmann: Sieht prima aus! :)
Du hast Deine Technik in kurzer Zeit deutlich verbessert, und ich wäre damit vermutlich schon als Endergebnis zufrieden.
Die blass erscheinende Färbung könnte auch durch die Fototechnik verursacht worden sein. Vielleicht kannst Du durch andere Belichtung und Bildbearbeitung noch etwas rausholen. Das viele Weiß im Bild macht ja die Belichtungsmessung etwas schwieriger.
Viele Grüße,
Bob
Hallo Gernot,
die Etzold Färbung ist gut gelungen. Differenziert mit 70% Ethanol und das Rot ist komplett weg. Klar, das ist ein netter Versuch, aber die Färbung ist hin. Bild 1 zeigt: da gibt es keinen Grund zu differenzieren!
Bei der Wackerfärbung meine ich fast, dass dafür der Schnitt zu dünn ist. Wo nix ist kann auch keine Farbe aufziehen. Du könntest beim Färben etwas erwärmen, da zieht mehr Farbe auf.
Aber ansonsten: du bist auf einem steil ansteigenden Lernkurve-Ast!
Noch eine kleine Ergänzung: bei botanischen Schnitten sind Schnittdicken ab 20µ aufwärts oft besser, weil im Gegensatz zu tierischem Gewebe das botanische nicht so dicht ist (von Lungengewebe abgesehen) "Häkeldeckchen" wird da auch weniger Farbe gebunden und die Schnitte werden blasser.
Wenn du etwas mehr verholztes nimmst wird der Rotanteil auch höher.
ZitatAstralblau-Safranin habe ich auch probiert, ist aber komplett daneben gegangen. (Geschätzte 1000Luftblasen). ist schon in der Tonne.
Das kann aber nicht an der Färbung liegen! Die Differenzierung mit Salzsäure-Ethanol ist m. E. zu heftig.
Liebes Beratungsteam,
vielen Dank für die aufmunternden Worte. Das baut natürlich ungemein auf!
Lieber Jürgen,
von den hier dargestellten Proben hat sich die Beschriftung der Klötzchen leider schon verabschiedet. aber auf einigen anderen kann ich lesen: "Butanol, Rotiplast". Es kann also angenommen werden, dass das auf alle Klötzchen zutrifft. Von der Fixierung kann man nichts finden.
Bei der Färbung bin ich wie folgt vorgegangen: 3x10min Roti-Histol - je 2x5min Iso 100%-98%-90%-60%-3x5min Aqua dest .- Wasser weitgehend abkippen bzw. absaugen - Schnitt mit Etzold ganz bedecken - Färbezeit 12,5min - Farbe absaugen - mit Wasser waschen bis keine Farbwolke mehr abgeht. Im Falle von Bild 2 habe ich mit 70% Etanol einige Sekunden fixiert. - Sofort mit 100% Isoprop in 3 Stufen- 10sek-2min-2min entwässern - mit Euparal wie beschrieben eindecken - und ab auf die Wärmeplatte mit ca 50°C.
Im Falle der Wacker-Färbung nach Aqua dest.: Mit der Rotkomponente min 5min färben - rot abziehen - mit Blau nachfärben 30sec. - mit Wasser waschen bis keine Farbe mehr abgeht - Wasser weitgehend entfernen und kurz mit 100% Isopropanol spülen - gleich das Iso wechseln ca1min dann nochmals frisches Iso ca 3min einwirken lassen - leicht feucht mit Euparal eindecken.
Hallo Bob,
ich glaube an der Fototechnik kann es nicht liegen. ich verwende eine Nikon D810, fotografiere nur in RAW und die Belichtung ermittle ich ausschließlich mit der Histogrammkurve, verlasse mich also nicht auf die interne Belichtungsmessung. Entwickelt wird dann in Lightroom. Da kommen die Farben fast genau so wie ich sie durch das Okular sehe.
Hallo Klaus,
Werde also künftig 30My für Botanik einstellen?
Sollte ich bei Astralblau-Safranin die Differenzierung mit Salzsäure-Ethanol ganz weglassen?
Ich lese immer wieder, dass für die Alkoholstufen Ehtanol verwendet wird. Andere empfehlen wieder Isopropanol (ist 2-Propanol das selbe?). Was ist dafür entscheidend, ob Ethanol oder Iso Verwendug findet?
Jetzt steht mir noch die dritte Stufe bevor, das Herstellen der Paraffinblöcke. Wie geht da der Hobbymikroskopiker am besten vor? soll man die Kassetten beschaffen oder mit den althergebrachten Holzklötzchen arbeiten?
Schöne Grüße
Gernot
Lieber Gernot,
die Arbeitsanweisung für Etzold findest Du in der Mikrofibel, bitte beachten, dass es zwei Varianten Etzold gibt. Hast Du nicht den mit dem Farbstoff bedeckten Ot erhitzt?
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Gernot,
an der Fototechnik wird es dann schonmal nicht liegen.
Zur Herstellung von Paraffinschnitten hat unser Georg Rosenfeld etwas geschrieben:
http://www.mikrohamburg.de/Tips/Paraffinschnitte_02.pdf (http://www.mikrohamburg.de/Tips/Paraffinschnitte_02.pdf)
Als er die Maus in der Zoohandlung kaufte, sagte der Verkäufer wohl, dass er an dem Tier sicher viel Freude haben werde... ;D
Viele Grüße,
Bob
Hallo Gernot,
Bei der Safranin Astrablaufärbung nur bei totaler Überfärbung mit HCl-Ethanol differenzieren.
Isopropanol ist Propanol-2 es härtet stärker als Ethanol.
20-30µ sind bei botanischen Proben nicht schlecht
Ich habe flexiblen Gießformen, das sind L-förmige Winkel, die zusammengelegt die variable Form ergeben. Von einem Profischnibbler. Eine ganze Schachtel voll. Ich würde sagen 5 Stück würden dir erst mal reichen. Hat dein Mikrotom denn einen Halter für Kasetten?
Zitat von: Jürgen H. in Oktober 30, 2018, 15:30:28 NACHMITTAGSdie Arbeitsanweisung für Etzold findest Du in der Mikrofibel, bitte beachten, dass es zwei Varianten Etzold gibt. Hast Du nicht den mit dem Farbstoff bedeckten Ot erhitzt?
Lieber Jürgen, bei der Etzold Färbung habe ich mich genau an die Vorschrift des Farblieferanten (Klaus Herrmann) gehalten.
Zitat von: Klaus Herrmann in Oktober 30, 2018, 16:50:09 NACHMITTAGSIch habe flexiblen Gießformen, das sind L-förmige Winkel, die zusammengelegt die variable Form ergeben. Von einem Profischnibbler. Eine ganze Schachtel voll. Ich würde sagen 5 Stück würden dir erst mal reichen. Hat dein Mikrotom denn einen Halter für Kasetten?
Hallo Klaus,
Mein Mikrotom hat eine einfache "Schraubstockhalterung" mit einer feststehenden Backe und einer mit Spindel verstellbaren Backe. Da dürfte man wohl nur Klötze einspannen können? Ja solche Winkel wären super. Wo bekomme ich die her?
Wenn ich nun pflanzliches Material in Paraffin einbetten will, welches Fixiermittel schlägst Du vor?
Hallo Bob,
danke für den Link, von Seite 14 bis 30, wo es um die Verarbeitung der Schnitte geht habe ich mir schon früher ausgedruckt. Jetzt sind eben noch die Seiten1-13 dazugekommen. Ich habe eben das Pferd von hinten aufgezäumt. ;)
Schöne Mikrogrüße
Gernot
Hallo Gernot,
ZitatJa solche Winkel wären super. Wo bekomme ich die her?
Eine sichere Quelle hätte ich anzugeben: bei mir. Ich bette nicht ein, deshalb kann ich sie auch gerne abgeben. Ich muss dann auch gleich mal schauen was es da noch hilfreiches in der Kiste gibt.
Zum Einbetten bin ich kein erfahrener Ratgeber, aber ich denke AFE ist nicht verkehrt.
Morgen schau ich nach und melde mich dann.
Bild: die 3 Varianten habe ich, sehr stabile Messingausführung.
Hallo Gernot,
AFE, dann absteigende Alkoholreihe, gut "Wässern" um die letzten Reste des AFE zu Entfernen.
Danach wieder Alkoholreihe aufsteigend, dann Paraffineinbettung mit Isopropanol als Intermedium (siehe Seite von Herrn Henkel).
Viel Erfolg
Joachim
Hallo Joachim,
Danke für Deinen Tipp. Ich lese auch immer wieder, dass man die Probe vor dem Einbetten entlüften soll. wie macht das der Hobbyschnippsler am besten? Welche Erfahrungen gibt es dazu?
Schöne Grüße
Gernot
Hallo Gernot,
ich denke zum Entlüften verwendet man einen Exsikkator. Wenn Du interessiert bist, kannst Du mir ja eine PN schreiben.
Ich habe einen zu verkaufen. Ist halt etwas groß das Ding.
Herzliche Grüße
Herbert
Hallo Gernot,
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4864.msg32523#msg32523 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4864.msg32523#msg32523)
das hat mir bisher gereicht.
Viele Grüße
Joachim
Zitat von: JoachimHLD in November 01, 2018, 10:27:34 VORMITTAGhttps://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4864.msg32523#msg32523 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4864.msg32523#msg32523)
das hat mir bisher gereicht.
Hallo Joachim,
super Lösung. Wie lange lässt man die Proben im Unterdruck?
schöne Grüße
Gernot
Hallo Gernot,
das hängt vom Material und der Größe des Objekts ab.
z.B. Holzstücke zum direkten Schneiden ca. 2h nachdem keine Gasbläschen mehr aufsteigen, weiches Material für Paraffinschnitte, sind ja kleine Stücke da da reicht es wenn keine Blasen mehr aufsteigen. Je größer das Objekt um so länger, der Unterdruck hält auch nicht ewig bei dieser Konstruktion.
Lies auch mal die Antwort auf Hans-Jürgens Bilder. Die Schnittdicke bei botanischem Material kann ruhig auch mal 25µ sein hängt alles vom Material ab.
Viel Spaß beim Üben!
Joachim
Hallo Gernot,
Du hast mich gebeten, ein Foto meines Exsikkators einzustellen. Ich will es mal versuchen, stell mich da noch etwas dumm an.
Herzliche Grüße
Herbert
quote author=Herbert Dietrich link=topic=32507.msg241051#msg241051 date=1541155547]Du hast mich gebeten, ein Foto meines Exsikkators einzustellen. Ich will es mal versuchen, stell mich da noch etwas dumm an.[/quote]
Hallo Herbert, das Foto ist ja bestens gelungen. Aber wie gesagt, für mein Mini-Hobbylabor zu umfangreich. Welchen Unterdruck erreicht man damit und wie kann man den regulieren?
In einem meiner Gläser sind noch einige paraffinfreie Handmikrotomschnitte in 70% Ethanol geschwommen. die habe ich jetzt nach R.D. Müller verarbeitet und nach K. Herrmann mit W3ASim II gefärbt. Da kommen die Farben aber schon ganz anders daher!
Liebe Grüße
Gernot
Hallo Gernot,
da kann ich in Abwandlung eines blöden Werbespruchs nur sagen: so muss Wacker! ;)