Sehr geehrte Nutzer dieses phantastischen Forums.
Ich beginnen meinen Beitrag mit einigen Beispielen, und schildere mein eigentliches Anliegen weiter unten. Bei den folgenden Abbildungen handelt es sich um Aufnahmen von Blutplättchen bei 100-facher Objektivvergrößerung mit einem Immersionsobjektiv im Dunkelfeld-Strahlengang.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25200_2415285.jpg) | (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25200_41578972.jpg) | (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25200_59114455.jpg) |
Bitte entschuldigen Sie, wenn ich Sie hier mit einem ganz konkreten Probelm belästige, das sicherlich nur einige wenige Mikroskop-/Mikrophotographie-Experten im Umkreis von München interessieren kann.
Ich arbeite seit einigen Jahren an der mikrophotographischen Dokumentation der zeitabhängigen Veränderungen von unfixierten Blutplättchen im Dunkelfeldpräparat. Ich hatte bislang immer mit einen Canon Powershot-Kamera am C-Mount gearbeitet und habe seit kurzem dank einer großzügogen Spende eine Zeiss-Axiocam zur Verfügung. Ich arbeite mit einem Leitz Laborlux Mikroskop mit Einschub-Dunkelfeldkondensor bei 100-facher Vergrößerung durch ein Immersionsobjektiv. Die interessierenden Strukturen finden sich an der Grenze der Auflösbarkeit im Bereich von ca 0,2 µm
Ich habe nun sehr viel hin und herprobiert und komme mit meinem ganzen Aufbau nicht mehr weiter. Ich bin Arzt und stoße bei den Fragen der Mikroskopie und Mikrophotographie schnell an die Grenzen meines technischen und physikalischen Verständnisses.
Ich brauche schärfere, besser kontrastierte Bilder! Ich würde so gerne einmal einem Experten, der sich wirklich mit digitaler Photographie von Mikroskopbildern auskennt, meinen ganzen Aufbau zeigen und erhoffe mir konkrete Vorschläge, wie und wo ich noch etwas verbessern kann. Ich bin gerne auch bereit, etwas dafür zu zahlen, muß aber gleich einschränken, daß ich nur über sehr begrenzte finanzielle Mittel verfüge, da ich diese selbst-finanzierte wissenschaftliche Arbeit nur als "Hobby" betreibe.
Ziel ist die Anfertigung von kontrastreichen und scharfen Bilderserien, die einer automatisierten Auswertung zugänglich sind.
Vielen Dank für Ihr Verständnis und für jede Unterstützung!
Max-Joseph Kraus
http://www.mjkraus.de
Hallo -
es darf nicht wundern, dass niemand geantwortet hat oder sich als Ausrüstungsexperte betätigen will! 0,2 µm Auflösung ist eine absolute physikalische Grenze der Auflösung unter speziellen Bedingungen, d.h. das mikroskopische Bild muss verschwommen aussehen.
In diesem Bereich sind Beobachtungen von Formveränderungen in Frischpräparaten halt nicht mehr möglich - zumindest nicht für uns Normalmikroskopiker.
Gruß
RB
Hallo RB,
vielen Dank für Ihre Antwort! Ja, das ist mir bewusst, daß ich mich hier an der Grenze des Möglichen bewege. Wenn ich aber das geballte Know-kow in diesem Forum sehe, bin ich sicher, daß an meinem Aufbau noch vieles verbessert werden könnte und daß ein erfahrener Mikro-Photograph relativ leicht erkennen könnte, was man hier noch tun könnte.
Es ist auch so, daß ich die Strukturen über das Okular durchaus ausreichend scharf dargestellt bekomme, daß es mir aber nicht gelingt, eine identisch scharfe Photographie herzustellen.
Ich würde mich sehr freuen und wäre sehr dankbar, wenn sich doch noch jemand bereit erklären würde.
Viele Grüße
Max-Joseph Kraus
Hallo,
ich bin hier wirklich der Letzte, der sich mit schönen Bildern auskennt ;D ;D ;D, (eher schon Experte für Nebelbilder :D) möchte aber mal aus eigenem Interesse zurück fragen:
Haben Sie schon alle erdenklichen Möglichkeiten für eine extrem erschütterungsarme Umgebung ausgereizt? Mir ist z.B. mal aufgefallen, dass meine Bilder noch deutlich nebliger werden, wenn der Zug in 200m Entfernung vorbei fährt.
Gruß, Oliver
Hallo Oliver,
nein, das habe ich noch nicht ausgereizt. Es ist mir genau genommen gar nicht so als Problem bewusst gewesen. Die Tram-Bahn fährt ganz in der Nähe vorbei. Könnte also wirklich ein Teil des Problems sein. Haben Sie eine Lösung, wie man das ganze erschütterungsfreier hinbekommt? Schaumgummi unter den Mikroskoptisch?
Danke für Ihre Info!
Max-Joseph Kraus
Zitat von: xammax in Dezember 09, 2009, 15:26:09 NACHMITTAGS
Hallo Oliver,
nein, das habe ich noch nicht ausgereizt. Es ist mir genau genommen gar nicht so als Problem bewusst gewesen. Die Tram-Bahn fährt ganz in der Nähe vorbei. Könnte also wirklich ein Teil des Problems sein. Haben Sie eine Lösung, wie man das ganze erschütterungsfreier hinbekommt? Schaumgummi unter den Mikroskoptisch?
Danke für Ihre Info!
Max-Joseph Kraus
Warten Sie lieber noch ein bisschen. Vielleicht sagt ja noch jemand etwas zu dieser Idee, der mehr davon versteht.
Wenn nicht, könnten Sie ja mal vorsichtig in dieser Richtung experimentieren.
Ich hätte jetzt allerdings eher gedacht, man reduziert die Erschütterungen, wenn man das Mikroskop fest mit einer massiven Oberfläche (Steinwägetisch z.B.) verbindet. Aber warten Sie besser noch auf andere Meinungen. (Man soll ja nicht gleich den Bock zum Gärtner machen :D)
Ich wünsche Ihnen aber auf jeden Fall viel Erfolg,
Oliver
Lieber Max-Joseph,
Schaumgummi bringt den Tisch nur in zusätzliche Schwingungen. Das auf keinen Fall ausprobieren.
Ansonsten kann ich keine Ratschläge geben. Da gibt es Spezialisten.
Liebe Grüße
Regi
Hallo Herr Kraus,
leider wohne ich im südlichen Hessen und kann Ihnen daher leider nicht mit einem persönlichen Besuch dienen (es sei denn Sie bezahlen mir Reise und Unterkunft; kleiner Scherz!).
Was ich aus dem mittleren Bild deutlich erkenne, ist dass die Kamera falsch adaptiert ist. Das wundert mich auch nicht, denn die Axiocam fordert ein auskorrigiertes Zwischenbild, was Ihr Laborlux nicht bietet, wenn, was ich annehme, Sie diese Kamera ohne Okular/Projektiv betreiben.
Im Übrigen habe ich das Problem, dass ich mit den Strukturen absolut nichts anfangen kann - kenne sie nicht. Ein Maßstab würde sicherlich helfen. Sollten sie wirklich in der angegebenen Größenordnung liegen, wären die Fotos fantastisch und verlangten eine gewisse Nachbereitung mit Photoshop oder Gimp o.ä.
Also, aus der Ferne dürfte Hilfe schwierig sein, aber vielleicht nicht unmöglich?!
Herzliche Grüße
Detlef Kramer
Hallo!
Ohne Experte für Dunkelfeldmikroskopie zu sein, dennoch meine Überlegung:
Für Jene, die keine Vorstellung von Thrombocyten ( Blutplättchen ) haben, hier einmal deren Aussehen im gefärbten Blutausstrich http://images.google.de/imgres?imgurl=http://i36.tinypic.com/mhraqo.jpg&imgrefurl=http://www.mikroskopie-forum.de/index.php%3Ftopic%3D3248.0&usg=__MAqJmjT8ffUh5d49RSsEZVzamM8=&h=574&w=760&sz=131&hl=de&start=4&um=1&tbnid=4x6oSWi-if6rFM:&tbnh=107&tbnw=142&prev=/images%3Fq%3Dthrombozyten%2Bausstrich%26hl%3Dde%26sa%3DN%26um%3D1
Ich gehe davon aus, dass dieses Bild des gefärbten Ausstrichs auch mit einem 100er ( evetuell 63er ) Ölimmersionsobjektiv angefertigt wurde. Man sieht also, wie "klein" die Thrombos sind. Das erste Foto zeigt mir den Thromcoyten so, wie ich ihn auch ( z.B. von EM-Aufnahmen ) kenne, mit den beiden weiteren Bildern kann ich auch nicht wirklich etwas anfangen. Ich finde sie aber erstaunlich "gelungen" und kann mir nicht vorstellen, dass Sie mit konventionellen lichtmikroskopischen Methoden und einer "hobbymäßig" bezahlbaren Ausrüstung zu ( noch ) besseren Ergebnissen kommen können.
Herzliche Grüße
Peter
hallo Herr Kraus,
grundsätzlich wäre es sicherlich hilfreich, wenn Sie Fotos von Ihrem Mikroskop zeigen könnten. Da ich selbst ein Laborlux-Mikroskop benutze/ benutzt habe, frage ich mich beispielsweise, was Sie mit "Einschub-Dunkelfeld-Kondensor" meinen. Ich hoffe, Sie meinen nicht den "normalen" Kondensor mit der NA 0,9, in den eine Dunkelfeldhülse eingeschoben werden kann. Diese ist nämlich nur für Objektive bis 40x gedacht. In meiner Laborlux-Broschüre ist nämlich kein echter Dunkelfeldkondensor als Zubehör für das Laborlux verfügbar. So wäre zumindest eine Ursache für die deutlich sichtbaren chromatischen Aberrationen sowie für den Lichtschleier in den Fotos wahrscheinlich.
beste Grüße Michael Plewka
Zitat von: Michael Plewka in Dezember 09, 2009, 21:39:54 NACHMITTAGS
. In meiner Laborlux-Broschüre ist nämlich kein echter Dunkelfeldkondensor als Zubehör für das Laborlux verfügbar.
Hallo Michael
ich darf mal zitieren aus meiner Laborlux Broschüre:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25422_43785854.jpg)
viele Grüsse
Bernhard
Liebe Herrschaften, so geht das nicht. Laborlux-Druckschriften gab es Dutzende in den dreieinhalb Jahrzehnten, in denen Instrumente dieses Namens in Wetzlar gebaut wurden. Geben Sie doch bitte wenigstens an, von welcher Art Laborlux Sie schreiben, aus welchem Jahrzehnt. Noch besser Nummer und Datum der Druckschrift.
KH
Zitat von: Klaus Henkel in Dezember 09, 2009, 22:41:06 NACHMITTAGS
Liebe Herrschaften, so geht das nicht. Laborlux-Druckschriften gab es Dutzende in den dreieinhalb Jahrzehnten, in denen Instrumente dieses Namens in Wetzlar gebaut wurden. Geben Sie doch bitte wenigstens an, von welcher Art Laborlux Sie schreiben, aus welchem Jahrzehnt. Noch besser Nummer und Datum der Druckschrift.
KH
Hallo Herr Henkel
Sie haben völlig Recht, ich bitte um Nachsicht! Es handelt sich um die Druckschrift 311.512-181 für Laborlux 12
Das Jahr ist nicht vermerkt.
Viele Mikrogrüsse
Bernhard
Hallo Herr Henkel
Hallo Herr Lebeda
ZitatSie haben völlig Recht, ich bitte um Nachsicht!
Gewährt!
ZitatEs handelt sich um die Druckschrift 311.512-181 für Laborlux 12
Das Jahr ist nicht vermerkt.
Wetten?
Entweder steht rechts neben der Druckschriftnummer eine Angabe etwa in folgender Form
VIII/79 Cx wb, bei Zeiss dahinter auch meist die Auflagenhöhe 4. oder 4.000. Also
August 1979.
Oder auf der letzten Seite, rechts unten am Rand, senkrecht.
Ordentliche Firmen machen das so seit 100 Jahren.
Beste Grüße
KH
Hallo Herr Kraus,
ich (Labormediziner am Hygieneinstitut Krefeld) finde Ihre Aufnahmen schon sehr gut. Ein wichtiges Problem sind sicherlich Unschärfen durch Erschütterungen beim Auslösen der Kamera und die Brownsche Molekularbewegung, wenn sie an suspendierten, frischen Thrombozyten arbeiten. Ist ein Arbeiten an fixierten Präparaten möglich? Eventuell kann die Fluoreszenzmikroskopie weiterhelfen. Mich interessiert sehr was Sie darstellen möchten, was ist der Zweck Ihrer Untersuchung? und mit welchen Präparaten arbeiten Sie? (Antikoaggulanz, buffy-coat?).
mfG, Ralf Feller
Hallo,
vielen Dank für die vielen Anregungen! Bitte entschuldigen Sie die unvollständigen Angaben zu den Bildern und meines System.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_50173928.jpg)
Thrombozyten sind der kleinste zelluläre Bestandteil des Blutes. Sie besitzen keinen eigenen Zellkern, sondern sind Abschnürungen von Zytoplasma aus sog. Megakaryozyten im Knochenmark. Thrombozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung, Aspirin wirkt zum Beispiel über eine Hemmung der Thrombozytenfunktion.
Wenn die Thrombozyten mit Glas in Berührung kommen, werden sie aktiviert. Das Zytoplasma stülpt sich aus, es werden Fortsätze gebildet, die zum Teil eine sehr erhebliche Länge und Menge bekommen können.
Wenn die Thrombozyten nun in meinem nach einem bestimmten Verfahren angelegten Präparat sich gegen das Objektglas absenken, werden sie langsam aktiviert. Man kann im Dunkelfeld recht genau beobachten, wie sich dieser Aktivierungsvorgang abspielt, wie die Fortsätze sich ausbilden, bewegen, langsam anhaften und der Thromboyzt dann nach einer Weile vollständig erstarrt.
Mir geht es jetzt um eine Objektivierung und Quantifizierung dieses Aktivierungsvorganges. Ich möchte hierzu die Anzahl, Länge und Breite der Fortsätze bestimmen.
Ein Thrombozyt ist durchschnittlich ca 2,5 µm breit, er bildet zwischen 1 und ca 50 Fortsätzen, die Fortsätze sind ca 0,5 bis 5 µm lang und haben eine Breite von ca 0,2 - 0,4 µm. Ich habe händisch schon eine ganze Reihe von Thrombozytenfortsätzen ausgezählt, das funktioniert ganz gut und dafür reicht auch die Qualität der Aufnahmen. Das dauert aber ewig und ist keinesfalls praxistauglich. Die Bilder sind wohl aber nach Auskunft von Experten in der automatischen Auswertung, für eine solche nicht scharf und kontrastiert genug. Das will ich jetzt verbessern, so es irgendwie möglich ist.
Da ich Foto-technisch ein echter Stümper bin, bin ich nach wie vor sicher, daß ich von Ihnen allen eine Menge wertvolle und hilfreiche Informationen bekommen könnte, um das ganze einfach besser hinzukriegen.
Ich arbeite zur Zeit mit folgendem Aufbau (schriftliche Details folgen weiter unten):
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_43234276.jpg) | (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_66494234.jpg) |
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_39450529.jpg) | (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_30443362.jpg) |
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_27774046.jpg) | (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_41872544.jpg) |
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_5216289.jpg) | (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25448_33406432.jpg) |
Mikroskop:Wild Leitz GMBH
Type 020-505.030
512859/105428
110/120-130/220-230/240-250V~
IC 280
50-60 Hz P max. 30W Birne 6V 20W
Made by Leitz Portugal
Lampenhaus:Leitz Wetzlar Germany
Type 307-150.001 514 725
Birne 12V max. 100W
Halogenbirne:Narva Plauen made in GDR
HLWS 5-A
12 V 100 W
Py 24-1,5
Lichtwurflampe mit Justiersockel
Trafo:Made in Switzerland by OMAG
for
WILD HEERBRUGG AG and
ERNST LEITZ WETZLAR GmbH
Type MTR 27
0-12V~
Total max 100W
Dunkelfeldkondensor:LEITZ WETZLAR GERMANY
513 547
D 1.19-1.44 OEL S11
Objektiv: (benutze ich üblicherweise)
Olympus Japan 100
A 100
1.30 oil
160/0.17
Objektiv-Alternative 1:Carl-Zeiss Jena 844419
Apochromat
HI 100/1,32
160/0,17
Objektiv-Alternative 2:519848
Leitz Wetzlar Germany
*160/0,17
PL Fluotar
100/1,32-060 Oil
C-Mount:0,63X
1/2"=11.6
2/3"=17,5
C-Mount-Alternative:0,5x:
1/2 Zoll = 16
Kamera alt (und leider kaputt):Canon Powershot A95 angeschlossen an PC über USB
Kamera neu:Leica DFC 295 angeschlossen an PC über Firewire
Der komische Holzkasten links neben dem Mikroskop ist ein Elektromotor, der den Z-Trieb automatisiert/automatisieren kann.
So, ich hoffe, ich habe alle notwendigen Daten vollständig erfasst und konnte meine Absichten klar machen.
Vielen Dank für alle Unterstützung!
Max-Joseph Kraus
Zitat von: Detlef Kramer in Dezember 09, 2009, 18:03:34 NACHMITTAGS
Was ich aus dem mittleren Bild deutlich erkenne, ist dass die Kamera falsch adaptiert ist. Das wundert mich auch nicht, denn die Axiocam fordert ein auskorrigiertes Zwischenbild, was Ihr Laborlux nicht bietet, wenn, was ich annehme, Sie diese Kamera ohne Okular/Projektiv betreiben.
Im Übrigen habe ich das Problem, dass ich mit den Strukturen absolut nichts anfangen kann - kenne sie nicht. Ein Maßstab würde sicherlich helfen. Sollten sie wirklich in der angegebenen Größenordnung liegen, wären die Fotos fantastisch und verlangten eine gewisse Nachbereitung mit Photoshop oder Gimp o.ä.
Also, aus der Ferne dürfte Hilfe schwierig sein, aber vielleicht nicht unmöglich?!
Hallo Herr Kramer,
die eingestellten Bilder sind noch mit der Canon Powershot A95 aufgenommen. Ich habe gerade nochmal alle Daten gepostet und dabei festgestellt, daß es sich gar nicht um eine Zeiss Axiocam sondern um eine Leica DFC 295 handelt. Habe die Kamera erst kürzlich bekommen und bin mit deren optimaler Einstellung sowieso noch reichlich überfordert. Wie muss ich das mit dem auskorrigierten Zwischenbild verstehen??? Was könnte ich da tun?
Die Hilfe aus der Ferne läßt sich gut an! Ich bin optimistisch!
Danke!
Max-Joseph Kraus
Zitat von: xammax in Dezember 10, 2009, 01:10:21 VORMITTAGWenn die Thrombozyten mit Glas in Berührung kommen, werden sie aktiviert. Das Zytoplasma stülpt sich aus, es werden Fortsätze gebildet, die zum Teil eine sehr erhebliche Länge und Menge bekommen können.
Hallo Herr Kraus,
ich bin völlig fachfremd und medizinisch unbedarft, aber ich meine mich zu erinnern, dass für solche Objekte (lebendige, extrem dünne und schwach absorbierende Körper auf Glassubstrat) bei Leitz der
Reflexionskontrast (bei Zeiss:
Antiflex-Methode) entwickelt wurde. Zur biomedizinischen Anwendung dieser Methode gibt es hier im Forum einen sehr profunden Kenner, dessen Beitrag Sie hier finden: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=1356.msg7191#msg7191.
Wenn ich es recht verstanden habe gibt es hier im Gegensatz zum Dunkelfeld-Kontrast keine Einbuße bei der Auflösung, da die Apertur nicht verringert werden muss.
Viel Erfolg!
Zitat von: Peter Voigt in Dezember 09, 2009, 20:24:32 NACHMITTAGS
... Das erste Foto zeigt mir den Thromcoyten so, wie ich ihn auch ( z.B. von EM-Aufnahmen ) kenne, mit den beiden weiteren Bildern kann ich auch nicht wirklich etwas anfangen. Ich finde sie aber erstaunlich "gelungen" und kann mir nicht vorstellen, dass Sie mit konventionellen lichtmikroskopischen Methoden und einer "hobbymäßig" bezahlbaren Ausrüstung zu ( noch ) besseren Ergebnissen kommen können.
Hallo Herr Voigt,
Die anderen Bilder zeigen auch Thrombozyten nach Aktivierung durch Glas. Die Beobachtung dieser Aktivierungsvorgänge ist (für mich) wirklich hochgradig faszinierend, ich habe zwischenzeitlich zigtausende von Bildern, die eingestellten Aufnahen sind natürlich besonders gelungen. Ich habe zeitliche Folgen über mehrere Tage aufgenommen, die Dynamik, die in diesen Präparaten herrscht, ist einfach nur faszinierend. WUNDER NATUR!!!
Ich hoffe doch, daß es besser geht!
Vielen Dank für Ihre Worte!
Max-Joseph Kraus
Zitat von: Ralf Feller in Dezember 10, 2009, 00:23:44 VORMITTAG
... ich (Labormediziner am Hygieneinstitut Krefeld) finde Ihre Aufnahmen schon sehr gut. Ein wichtiges Problem sind sicherlich Unschärfen durch Erschütterungen beim Auslösen der Kamera und die Brownsche Molekularbewegung, wenn sie an suspendierten, frischen Thrombozyten arbeiten. Ist ein Arbeiten an fixierten Präparaten möglich? Eventuell kann die Fluoreszenzmikroskopie weiterhelfen. Mich interessiert sehr was Sie darstellen möchten, was ist der Zweck Ihrer Untersuchung? und mit welchen Präparaten arbeiten Sie? (Antikoaggulanz, buffy-coat?).
Hallo Herr Feller,
ich habe zwischenzeitlich in meiner Antwort mit der Angabe der ganzen Mikroskopdaten schon näheres zu meinen Absichte geschrieben.
Ich benutze einfaches Citratblut (3,2 %, Natrium-gepuffert, 0,105 Molar). Meine kurzfristige Absicht ist, die Aktivierungsvorgänge, die ich schon seit Jahren im Dunkelfeld beobachte, in objektive Zahlen zu fassen. Ich möchte dann untersuchen/nachweisen, daß das so dargestellte Aktivierungsverhalten der Thrombozyten medikamentös beeinflusst werden kann (Stichwort: ASS-Resistenz). Ein zweiter längerfristiger Ansatzpunkt ist, daß es Hinweise gibt, daß die morphologischen Unterschiede im Aktivierungsverhalten, also die Form der Fortsätze, auf das Bestehen/die Anlage verschiedener Krankheiten hinweisen kann (z.B. Diabetes). Diese Aussage möchte ich gerne nachweisen oder widerlegen.
Ich brauche hierfür aber unbedingt ein praktikables Verfahren, daß mir schnell meine Beobachtungen in Zahlen umsetzt. Ich habe deshalb schon Kontakt zu verschiedenen Bildbearbeitern aufgenommen, diese fordern aber widerum schärfere, kontrastreichere Bilder.
Fixierte Präparate gehen leider nicht, die Lebendzellbeobachtung ist sozusagen gerade der Clou an der ganzen Geschichte.
Die Leica-Kamera macht jetzt praktisch keine Auslösebewegungen mehr, ich hoffe auch, daß das schon etwas bessert.
Vielen Dank für Ihr Interesse und Ihre freundlichen Worte.
Max-Joseph Kraus
Hallo Herr Kraus,
als allererste Massnahme würde ich den PC vom Regal nehmen. Festplatte und Lüfter bringen Vibrationen ins Spiel.
Dann würde ich die Kameraadaption testen. Objektträger mit mm Skala drunter und aufnehmen. Nicht nur mit dem 100x sondern die ganze Objektivreihe. Eine fehlerhafte Adaption ist auf den resultierenden Bildern erkennbar.
Wenn die Adaption in Ordnung ist würde ich mit einem Diatomeen Testpräparat Dunkelfeldaufnahmen machen. Wenn diese auch OK sind - dann können sie davon ausgehen, dass Ihr Setup in Ordnung ist.
Aber ich glaube, auf dem Weg werden Sie die eine oder andere Überraschung erleben.
Herzliche Grüsse
Eckhard Völcker
Zitat von: Eckhard in Dezember 10, 2009, 09:09:42 VORMITTAG
Hallo Herr Kraus,
als allererste Massnahme würde ich den PC vom Regal nehmen. Festplatte und Lüfter bringen Vibrationen ins Spiel.
Dann würde ich die Kameraadaption testen. Objektträger mit mm Skala drunter und aufnehmen. Nicht nur mit dem 100x sondern die ganze Objektivreihe. Eine fehlerhafte Adaption ist auf den resultierenden Bildern erkennbar.
Wenn die Adaption in Ordnung ist würde ich mit einem Diatomeen Testpräparat Dunkelfeldaufnahmen machen. Wenn diese auch OK sind - dann können sie davon ausgehen, dass Ihr Setup in Ordnung ist.
Aber ich glaube, auf dem Weg werden Sie die eine oder andere Überraschung erleben.
Herzliche Grüsse
Eckhard Völcker
Hallo Herr Völcker,
vielen Dank für diese konkreten Hinweise. Wie macht man ein Diatomeen Testpräparat? Oder sollte ich das irgendwo kaufen?
Viele Grüße
Max-Joseph Kraus
Hallo Herr Kraus,
für Diatomeen Testpräparate sprechen Sie einfach Herrn Dr. Ralf Nötzel aus diesem Forum an. Sagen Sie ihm welche Auflösung Sie für Ihre Untersuchungen anstreben. Er kann Sie sicherlich beraten welche Präparate für Sie in Frage kommen.
Herzliche Grüsse
Eckhard Völcker
Hallo Herr Kraus,
ich gebe Eckhard Völcker recht, dass Sie wahrscheinlich noch einen längeren Weg vor sich haben. Aber so schlecht sieht die Sache doch nicht aus und das letzte Foto ist eigentlich schon beeindruckend.
Zur automatischen Analyse bräuchte man bei solchen Fotos eigentlich nur eine Art Zweiton-Isohelie zu machen. D.h. man hebt den Kontrast so stark an, dass nur noch schwarz und weiß übrig bleiben und legt die Schwelle mit dem Helligkeitsregler so, dass der Übergang Schwarz/Weiß an der richtigen Stelle liegt. Das kann jedes Bildbearbeitungsprogramm. Am besten wäre es, Sie fänden jemand, der sich mit ImageJ auskennt. Damit geht das alles und auch die Auswertung. Mit diesem Programm könnte man die Analyse sogar automatisieren, entweder mit einem der in die Tausende gehenden Scripte (plug-ins) oder indem man ein spezielles Script schreibt. Ich bin dazu zu alt und zu doof, aber es soll nicht schwer sein. Eventuell geht das Ganze sogar mit der Software, die der Kamera beigelegen hat.
Zum auskorrigierten Zwischenbild: Fast alle Mikroskopobjektive aus der Endlich-Zeit, die von Leitz gehören dazu, sind mit bestimmten Fehlern behaftet, die von den Okularen kompensiert werden müssen. Projeziert man das Zwischenbild ohne ein solches kompensierendes Okular (resp. Projektiv) direkt auf den Chip, findet man diese Fehler natürlich im Bild wieder. In Ihrem Fall bin ich mir da aber nicht sicher, da wir jetzt wissen, dass die Kamera von Leica ist. Dieses System kenne ich nicht und es kann sein, dass da eine kompensierende Optik integriert ist. Das müsste man klären. Die ganze Einschränkung gilt aber sowieso nicht für Strukturen in der Bildmitte.
Also ich denke, die Probleme sind lösbar.
Beste Grüße
Detlef Kramer
Hallo -
Sie schreiben, dass Ihr Lieblingsobjektiv das Olympus 100 ist - ergänzend zum Vorredner wollte ich deshalb noch auf dessen eigene interessanten Untersuchungen hinweisen:
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=3697.0. Allerdings spielt dies, wie gesagt, in der Bildmitte kaum eine Rolle, höchstens als Farbsäume an Strukturen, die außerhalb der Schärfeebene liegen (ich glaube, das sieht man auf Ihrem Foto).
Zu berücksichtigen ist allerdings auch, dass Ihre Präparate wohl relativ dick sein müssen, wenn Sie das Absinken der Ts. auf das Glas beobachten und sich wohl eine Serumschicht zwischen Objekt und Deckglas befindet, welche optisch ungünstig ist.
Selbst bin ich von dem Phänomen auch betroffen, dass meine Photos von Blutausstrichen mit dem 100er Öl (in diesem Falle Durchlicht mit einem Zeiss Planapo) nicht so scharf wirken, wie sie mir durchs Okular erscheinen. Dass aber Thrombos so groß werden können war mir als Halblaien auf diesem Gebiet auch neu - stimmt der 5µ Maßbalken tatsächlich?
Ansonsten drücke ich für Ihre Arbeit die Daumen, nachdem ich mich (wie wohl andere Forumsteilnehmer) davon überzeugen konnte, dass diese nichts mit der üblichen Artefaktkunde von Dunkelfeld-Blutmikroskopikern zu tun hat.
Freundliche Grüße
RB
Hallo,
für Höchstauflösung ist hier im Forum eigentlich Herr Höbel zuständig, aber da er sich nicht meldet werde auch ich noch meinen "Senf" dazugeben.
Da die Farbinformation offensichtlich nicht notwendig ist könnte man, falls die nicht CVD korrigiert angepasste Kamera stört, mit einem Interferenzfilter monochromatisch im blauen Licht beleuchten. Dann schlägt die CVD nicht zu und man hat durch die kleinere Wellenlänge noch eine Auflösungsverbesserung. Eventuell könnte man, wie Herr Höbel, sogar noch mit einer UV - LED beleuchten und nochmal Auflösung/Kontrast gewinnen falls die Lebendpräparation das aushält.
hochauflösende Grüsse
Wilfried
Hallo!
mal ein banale Frage zu Darstellung: Bin ich deer Einzige, der nicht alle Bilder Ihres beitrages, in welchen Sie Ihre Ausrünstung zeigen, sehen kann? Von den jeweils rechten Bildern sehe ich mit meinen beiden verschiedenen Browsern nur einen kleinen Teil.
Ansonsten bin ich übrigens auch erfreut, dass die Darstellung Ihres Vorhabens gezeigt hat, dass es sich hier nicht -wie von mir initial befürchtet - um eine weitere esoterische Spielart von "Enderlein" handelt.
Herzliche Grüße
Peter
Lieber Peter,
Herr Kraus hat nur die Fotos zu groß gemacht. Wenn Du ganz runter gehst in der Seite findest Du den horizontalen Scroller (oder, wie immer man das Ding nennt). Schieb den nach rechts und Du siehst alles.
Gruß
Detlef
Lieber Detlef,
mit dem Scrollbalken ist nichts zu machen. Aber ich habe die Bilder nun gesehen, indem ich die Schriftdarstellung im IE einfach skaliert habe. Allerdings ist dann die Schrift unlesbar. Aber man kann halt nicht alles gleichzeitig haben ( außer vielleicht Du, als Macianer ).
Herzliche Grüße
Peter
Nein,
das hat nichts mit Mac oder Windoof zu tun: Verabschiede Dich endlich von dem IE. Lad Dir den kostenlosen Firefox runter und Du bist alle Probleme los!
Herzliche Gute Nacht-Grüße
Detlef
Hallo,
ich habe gerade die Größe der Bilder verkleinert auf 250 px Breite und nochmal hochgeladen, jetzt sollten alle Bilder auch unabh. vom verwendeten Browser anzeigbar sein.
Im Fall des Falles kann man immer noch mit der rechten Maustaste auf das Bild gehen, Grafik anzeigen auswählen, dann sieht man auf jeden Fall das ganze Bild.
Entschuldigung für diesen Fehler.
Max-Joseph Kraus
Hallo,
@Eckhard
Zitat
als allererste Massnahme würde ich den PC vom Regal nehmen. Festplatte und Lüfter bringen Vibrationen ins Spiel.
Dann würde ich die Kameraadaption testen. Objektträger mit mm Skala drunter und aufnehmen. Nicht nur mit dem 100x sondern die ganze Objektivreihe. Eine fehlerhafte Adaption ist auf den resultierenden Bildern erkennbar.
Ich habe heute sofort das Labor entsprechend umgebaut. War ja einfach und erscheint mir wirklich sinnvoll.
Sonst sehe ich meine allernächste Aufgabe jetzt auch erstmal in einer erneuten optimalen und sicheren Adaptation der Kamera, habe ich mir für heute Nacht noch vorgenommen.
@TPL
Zitatich bin völlig fachfremd und medizinisch unbedarft, aber ich meine mich zu erinnern, dass für solche Objekte (lebendige, extrem dünne und schwach absorbierende Körper auf Glassubstrat) bei Leitz der Reflexionskontrast (bei Zeiss: Antiflex-Methode) entwickelt wurde. Zur biomedizinischen Anwendung dieser Methode gibt es hier im Forum einen sehr profunden Kenner, dessen Beitrag Sie hier finden: http://www.mikroskopie-fo...opic=1356.msg7191#msg7191.
Ganz vielen Dank für diesen tollen Hinweis. Ich hatte heute bereits ein ausführliches und sehr hilfreiches Telefonat mit Prof. Piper.
@Detlef Kramer
ZitatZum auskorrigierten Zwischenbild: Fast alle Mikroskopobjektive aus der Endlich-Zeit, die von Leitz gehören dazu, sind mit bestimmten Fehlern behaftet, die von den Okularen kompensiert werden müssen. Projeziert man das Zwischenbild ohne ein solches kompensierendes Okular (resp. Projektiv) direkt auf den Chip, findet man diese Fehler natürlich im Bild wieder. In Ihrem Fall bin ich mir da aber nicht sicher, da wir jetzt wissen, dass die Kamera von Leica ist. Dieses System kenne ich nicht und es kann sein, dass da eine kompensierende Optik integriert ist. Das müsste man klären. Die ganze Einschränkung gilt aber sowieso nicht für Strukturen in der Bildmitte.
Hier bin ich jetzt überfordert, was zu tun ist. Die Bildmitte ist zwar am wichtigsten, natürlich hätte ich gerne das Bild möglichst weit bis an die Ränder scharf. Brauche ich ein Okular für den C-Mount???
Viele Grüße
Max-Joseph Kraus
Hallo -
mich wundert, dass von den einschlägigen Fachleuten der Tip mit der Blitzbeleuchtung noch nicht gekommen ist!? Für diese Problematik mit winzigen, beweglichen Strukturen scheint mir das doch optimal.
Gruß
Rolf
(Leider noch ohne Blitz und mit IE, trotzdem sehe ich alle Fotos von denen ich fasziniert bin)
Zitat von: xammax in Dezember 10, 2009, 22:36:43 NACHMITTAGS
Die Bildmitte ist zwar am wichtigsten, natürlich hätte ich gerne das Bild möglichst weit bis an die Ränder scharf. Brauche ich ein Okular für den C-Mount???
Das kommt darauf an, wie meistens.
Schauen Sie bei abgenommener Kamera mal in den Fototubus, ob im C-mount-Adapter eine Linse ist. Aber Vorsicht, manchmal ist nur ein planparalleles Abdeckglas darin, gelegentlich aber ein Linsensystem, das den Farbvergrößerungsfehler (und weitere Abbildungsfehler) des Objektivs beseitigt. Das macht man deshalb so, weil der Chip der Videokamera so klein ist, daß 80 % des von einem (ca. zehnfachen) Okular gelieferten Bildes an ihm vorbeigehen würden. Wenn das Chip-Bild, das aus nur 20 % des vom Okular gelieferten Bildes besteht, dann noch vergrößert wird, zum Beispiel auf dem PC-Monitor oder einem Papierbild, wäre man sofort außerhalb des Bereichs der sogen.
förderlichen Vergrößerung und im Bereich der
leeren Vergrößerung. Die förderliche Vergrößerung liegt zwischen dem 500- und dem 1000-fachen der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs. Vergrößert man stärker, wird zwar das Endbild größer, zeigt aber keine zusätzlichen Details. Der Gewinn an Vergrößerung bleibt "leer", man vergrößert nur die Unschärfe.
Wenn ein Linsensystem im C-mount-Tubus ist, brauchen Sie kein Okular - für eine C-mount-Kamara!
Mehr kann ich dazu nicht beitragen, weil ich nicht weiß, inwieweit Zeiss die Kamera an das Leitz-Mikroskop fachgerecht angepaßt hat. Bei der Verwendung von Objektiven hoher Apertur und Vergrößerung, können sich selbst geringfügige Unvollkommenheiten bei der Justage von Mikroskop und Kamera in Punkto Kontrast, Schärfe und Farbreinheit recht drastisch auswirken; je besser das Objektiv korrigiert ist, je teurer es also war, um so mehr.
Gruß KH
ZitatMehr kann ich dazu nicht beitragen, weil ich nicht weiß, inwieweit Zeiss die Kamera an das Leitz-Mikroskop fachgerecht angepaßt hat
Hallo Klaus,
das ist doch durchgängig Leitz und der C-mount ist, so wie ich das sehe 0,63. Der hat eine Optik nur der 1x ist leer.
Nur der Oly-Achromat ist ein Stilbruch, den ich nicht verstehe.
Was mich aber wundert, dass der C-mount nicht ganz unten sitzt, oder täusche ich mich da?
ZitatIch möchte dann untersuchen/nachweisen, daß das so dargestellte Aktivierungsverhalten der Thrombozyten medikamentös beeinflusst werden kann (Stichwort: ASS-Resistenz). Ein zweiter längerfristiger Ansatzpunkt ist, daß es Hinweise gibt, daß die morphologischen Unterschiede im Aktivierungsverhalten, also die Form der Fortsätze, auf das Bestehen/die Anlage verschiedener Krankheiten hinweisen kann (z.B. Diabetes). Diese Aussage möchte ich gerne nachweisen oder widerlegen.
Haben Sie - oder die einschlägige Fachliteratur, von der ich annehmen möchte, daß sie existiert - einmal überlegt, ob es Einflüsse
außerhalb der Thr. geben könnte, welche die Erscheinungen hervorrufen, die Sie mit "Aktivierungsverhalten" bezeichnen? Wie gut ist denn das untersucht? Könnte es sich bei dem "Ausfahren!" der Fortsätze nicht auch um einen rein physikalischen Effekt handeln, der beim Absterben der Thr. auftritt? Die Thr. auf Ihren Fotos machen den Eindruck deutlicher Regelmäßigkeit, eine Erscheinung wie sie auch auf Druck oder auf unterschiedliche Dichteunterschiede zustande kommen können. Leider verstehe ich von den Thr. nichts, so daß mein Hinweis hier nur eine vage Möglichkeit andeuten kann.
Ich kenne den Fall einer biol.natw. Assistentin, die zwei Jahre alle bedeutenden Mikroskophersteller, Agfa und Kodak und die mediz. Fakultäten von drei Unis beschäftigt hat, weil sie in ihrem Augenwasser bewegliche Organismen gefunden hatte, die niemand bestimmen konnte. Man bestätigte Ihr die "Organismen", konnte aber nicht helfen, es blieb rätselhaft. Sie zeigte uns am Mikrostammtisch dann die Fotos und machte mit ihren Fingern vor, wie die Organismen sich bewegten. Nach einer Runde Bier war der Fall dann geklärt, weil uns die Farbe der Organismen doch sehr derjenigen Ihres Laborkittels glich. Wer jemals Baumwollfäden in einer Flüssigkeit unter dem Mikroskop beobachtet hat, wird wissen, wovon ich rede. Die drehen und wenden sich, zucken und krümmen sich, daß einem angst und bange werden könnte. Alles reine Physik.
Naja, jedenfalls ist die Geschichte lustig gewesen.
KH
Zitat von: Klaus Herrmann in Dezember 10, 2009, 23:39:06 NACHMITTAGS
Mehr kann ich dazu nicht beitragen, weil ich nicht weiß, inwieweit Zeiss die Kamera an das Leitz-Mikroskop fachgerecht angepaßt hat
Zitat
Hallo Klaus,
das ist doch durchgängig Leitz und der C-mount ist, so wie ich das sehe 0,63.
Ja, war ein Mistverständnis von mir.
KH
Zitat von: Klaus Henkel in Dezember 10, 2009, 23:48:14 NACHMITTAGS
...Haben Sie - oder die einschlägige Fachliteratur, von der ich annehmen möchte, daß sie existiert - einmal überlegt, ob es Einflüsse außerhalb der Thr. geben könnte, welche die Erscheinungen hervorrufen, die Sie mit "Aktivierungsverhalten" bezeichnen? Wie gut ist denn das untersucht? Könnte es sich bei dem "Ausfahren!" der Fortsätze nicht auch um einen rein physikalischen Effekt handeln, der beim Absterben der Thr. auftritt? Die Thr. auf Ihren Fotos machen den Eindruck deutlicher Regelmäßigkeit, eine Erscheinung wie sie auch auf Druck oder auf unterschiedliche Dichteunterschiede zustande kommen können. Leider verstehe ich von den Thr. nichts, so daß mein Hinweis hier nur eine vage Möglichkeit andeuten kann...
Hallo Herr Henkel,
vielen Dank für Ihren Hinweis. Ja, natürlich habe ich diese Möglichkeit in Betracht gezogen und ziehe sie auch weiterhin in Betracht.
Ich habe das Untersuchungsverfahren vor 15 Jahren von dem Erstbeschreiber des Verfahrens (1960) erlernt. Seit damals beschäftige ich mich mehr oder weniger mit diesem Thema. Seit mittlerweilen 5 Jahren hat sich für mich die Möglichkeit ergeben, das ganze unter einem wissenschaftlichen Gesichtspunkt aufzuarbeiten. Ich habe zwischenzeitlich meine Praxis aufgebaut und bin Vater von vier kleinen Kindern, dies nur als Erklärung, warum ich noch nicht schon viel weiter mit allem bin. Ich habe ca. 100 verschiedene Blutproben untersucht und eine Vielzahl von Phänomenen gesehen, die ich (noch) nicht einordnen kann.
Um hier wirklich weiterzukommen, brauche ich eine effektive und zuverlässige Quantifizierung der Effekte, um ausreichend große Anzahlen von Thrombozyten verschiedener Personen untersuchen zu können. Ich habe viel Zeit darauf verwendet, die mir wesentlich erscheinenden Veränderungen herauszufiltern und mich immer weiter auf die oben beschriebenen Kernfaktoren reduziert. Diese Kernfaktoren sollten einer automatischen Auswertung zugänglich sein.
Im Netz findet sich z.B. hier http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/Bilder/de/Newsfotos/blutkoerper,property=bild,bereich=bio,sprache=de,width=286,height=208.jpg die Rasterelektronische Aufnahme eines Thrombozyten. Es gibt viele weitere Untersuchungen, die nahelegen, daß das von mir beobachtete Verhalten tatsächlich ein Aktivierungsverhalten ist, abschließend bewiesen ist es nicht. Wenn ich selber Aspirin eingenommen habe, kann ich die Veränderungen in meinem Blut nicht beobachten, das spricht für einen Aktivierungsvorgang.
Aber es ist tatsächlich in der gesamten Thrombozytenforschung noch sehr vieles unklar und umstritten, das macht es für mich auch gerade so spannend.
Ich rechne aber tatsächlich auch damit, daß am Ende meiner Untersuchungen die Erkenntnis steht, daß es sich hier um rein physikalische Effekte handelt. Nichtsdestotrotz hätte es sich für mich dann rentiert, ich wüsste eine Sachen genauer und hätte dabei einen Riesen Spaß gehabt.
Viele Grüße
Max-Joseph Kraus
Zitat von: Klaus Henkel in Dezember 10, 2009, 23:19:02 NACHMITTAGS
Zitat von: xammax in Dezember 10, 2009, 22:36:43 NACHMITTAGS
Die Bildmitte ist zwar am wichtigsten, natürlich hätte ich gerne das Bild möglichst weit bis an die Ränder scharf. Brauche ich ein Okular für den C-Mount???
Das kommt darauf an, wie meistens.
Schauen Sie bei abgenommener Kamera mal in den Fototubus, ob im C-mount-Adapter eine Linse ist. Aber Vorsicht, manchmal ist nur ein planparalleles Abdeckglas darin, gelegentlich aber ein Linsensystem, das den Farbvergrößerungsfehler (und weitere Abbildungsfehler) des Objektivs beseitigt. Das macht man deshalb so, weil der Chip der Videokamera so klein ist, daß 80 % des von einem (ca. zehnfachen) Okular gelieferten Bildes an ihm vorbeigehen würden. Wenn das Chip-Bild, das aus nur 20 % des vom Okular gelieferten Bildes besteht, dann noch vergrößert wird, zum Beispiel auf dem PC-Monitor oder einem Papierbild, wäre man sofort außerhalb des Bereichs der sogen. förderlichen Vergrößerung und im Bereich der leeren Vergrößerung. Die förderliche Vergrößerung liegt zwischen dem 500- und dem 1000-fachen der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs. Vergrößert man stärker, wird zwar das Endbild größer, zeigt aber keine zusätzlichen Details. Der Gewinn an Vergrößerung bleibt "leer", man vergrößert nur die Unschärfe.
Wenn ein Linsensystem im C-mount-Tubus ist, brauchen Sie kein Okular - für eine C-mount-Kamara!
Mehr kann ich dazu nicht beitragen, weil ich nicht weiß, inwieweit Zeiss die Kamera an das Leitz-Mikroskop fachgerecht angepaßt hat. Bei der Verwendung von Objektiven hoher Apertur und Vergrößerung, können sich selbst geringfügige Unvollkommenheiten bei der Justage von Mikroskop und Kamera in Punkto Kontrast, Schärfe und Farbreinheit recht drastisch auswirken; je besser das Objektiv korrigiert ist, je teurer es also war, um so mehr.
Gruß KH
Ja, da ist ein Linsensystem im C-Mount.
Ich habe heute bei einer 10-er Vergrößerung im Durchlicht die verschiedenen C-Mounts verglichen, der 0,63 scheint mir die beste Qualität zu geben.
Weiterhin habe ich das Mikroskop heute gründlich durchgeputzt, das hat auch etwas geholfen.
Viele Grüße
mjk
Zitat von: Klaus Herrmann in Dezember 10, 2009, 23:39:06 NACHMITTAGS
Nur der Oly-Achromat ist ein Stilbruch, den ich nicht verstehe.
Was mich aber wundert, dass der C-mount nicht ganz unten sitzt, oder täusche ich mich da?
Hallo Herr Herrmann,
vielen Dank für diesen Hinweis. Manchmal sieht man den Wald vor lauter Bäumen nicht! Ich habe mein ganzes Equipment ja gebraucht zusammengesammelt. Der C-Mount auf der Abbildung ist tatsächlich abgesägt, vermutlich zur Adaptation einer anderen Kamera. Ich hatte noch einen anderen Trinokulartubus, hier ist der C-Mount original und jetzt passt auch der Adapter viel besser. Das macht alles schon viel leichter, bei dem bisherigen C-Mount musste ich den Adapter immer ca 5 mm nach oben ziehen und mit einer Schraube fixieren, um ein scharfes Kamerabild zu bekommen.
Das Olympus Objetiv hatte ich als erstes und ich habe mich daran gewöhnt. Das ist aber wohl gar keine so gute Idee, oder? Welches der anderen beiden 100er Objektive ist denn erwartungsgemäß das geeignetere?
Ich muss mich immer wieder entschuldigen: die Fragen der Optik sind für mich doch sehr geheimnissvoll, ich verstehe fürchterlich vieles nicht wirklich.
Viele Grüße
mjk
Zitat von: Peter Voigt in Dezember 10, 2009, 21:23:45 NACHMITTAGS
Ansonsten bin ich übrigens auch erfreut, dass die Darstellung Ihres Vorhabens gezeigt hat, dass es sich hier nicht -wie von mir initial befürchtet - um eine weitere esoterische Spielart von "Enderlein" handelt.
Hallo Herr Voigt,
ja, mit dieser Assoziation hatte ich anfangs sehr viel zu kämpfen. Zwischenzeitlich habe ich mich innerlich so weit von allen Enderlein und Co - Untersuchungen distanziert, daß ich es bei der Vorstellung im Forum schon gar nicht mehr bedachte, mich von vornerein explizit von diesen Untersuchungen zu distanzieren.
Viele Grüße
mjk
Zitat von: reblaus in Dezember 10, 2009, 22:54:44 NACHMITTAGS
mich wundert, dass von den einschlägigen Fachleuten der Tip mit der Blitzbeleuchtung noch nicht gekommen ist!? Für diese Problematik mit winzigen, beweglichen Strukturen scheint mir das doch optimal.
Rolf
Die Strukturen sind ja nicht beweglich, nur in dem Augenblick, in dem sie ihre "Pseudopodien" ausstrecken. Danach werden sie absterben, wie alle Bestandteile des Blutplasmas, und zwar innerhalb kürzester Zeit. Blut verliert sehr schnell sein "Leben".
Aber trotzdem ist Ihr Vorschlag bedenkenswert. Doch zuerst ist die Kameraadaption in Ordnung zu bringen, sonst bringt auch ein Blitz keine scharfen Fotos.
KH
Hallo Herr Kraus,
ich hatte mich anfangs zurückgehalten weil ich dachte schon wieder E....lein ;D, aber was Sie da machen ist ja schon verblüffend!
Zum Objektiv kann ich mir vorstellen, dass das unter den Alternativen, die Sie haben das beste Ergebnis bringen sollte:
Objektiv-Alternative 2:
519848
Leitz Wetzlar Germany
*160/0,17
PL Fluotar
100/1,32-060 Oil
Manchmal ist es sogar besser ein 63er zu nehmen, dann aber mit Apertur 1,4. gibt es als Planapo von Zeiss (aber Vorsicht, die sind oft delaminiert!)
Bei Leitz gibt es ein 1,4er glaube ich nicht. Ich habe ein Planapo 1,32 von Leitz, da ist allerdings Öl in die Optik gelaufen :'( Permanente Ölimmersion ;D
Das 63er hat den Vorteil, dass die Schärfentiefe etwas größer ist, als beim 100er. Sie haben allerdings so kleine Strukturen, dass man die hohe Vergrößerung schon brauchen wird. Aber probieren sollten Sie es doch mal. Aber Unbedingt meine Warnung beachten!
Das Zeiss hat wohl keine Irisblende? Dann ist es für DF auch nicht geeignet, weil sie ja die Apertur mit der Irisblende verkleinern müssen für DF-Anwendung.
Hallo KH -
Blitzen wegen Beweglichkeit der Objekte bezog sich hauptsächlich auf den berechtigten Hinweis von R. Feller: Brownsche Molekularbewegung und verwandte, langsamere Phänomene. Hat ja schon Einstein einen netten Artikel geschrieben auf den irgendwo hier im Forum mal hingewiesen wurde.
Gruß
RB
Hallo,
ZitatBei Leitz gibt es ein 1,4er glaube ich nicht. Ich habe ein Planapo 1,32 von Leitz, da ist allerdings Öl in die Optik gelaufen Permanente Ölimmersion
doch gibt´s, ging gerade gestern über den Ladentisch bei Ebay in der Version für 160 mm TL, ist aber sehr selten.
Hallo,
ich habe jetzt erste kleine Fortschritte gemacht. Ich baue gerade das ganze System neu auf, habe das Labor umgestellt, das Mikroskop steht auf einem weitgehend wackelfreien Tisch, habe die Lichtquelle noch etwas verbessert, alles geputzt, das Leitz Fluotar Objektiv als Hauptobjektiv eingebaut, den anderen Trinokoluartubus installiert, damit eine viel einfachere Adaptation erreicht und habe begonnen vom 10er Objektiv aufwärts im Hell- und Dunkelfeld Aufnahmen mit der Mikrometerskala zu machen, um hier möglichst scharfe Aufnahmen hinzukriegen. Ich werde hieran jetzt erstmal weiterarbeiten. Ich denke auch, daß der allererste Schritt eine möglichst perfekte Kameraadaptation sein muß. Hierzu werden sich sicherlich in den nächsten Tagen Fragen ergeben.
Um Ihnen einen Eindruck von der erwähnten Bild-Dynamik zu vermitteln habe ich drei Bilderserien hochgeladen:
http://www.mjkraus.de/download/mikrobilder/!Slideshows/030_5_bilder.exe 1,3 MB, ca. 1/2 Stunde Beobachtungszeit
http://www.mjkraus.de/download/mikrobilder/030_Anfang.exe 7,3 MB, ca. 2 Stunden Beobachtungszeit
http://www.mjkraus.de/download/mikrobilder/030_kurz.exe 35,5 MB, ca. 12 Stunden Beobachtungszeit
(die Exe-Dateien sind bei mir geprüft und Virus-frei)
Die gesamte Sequenz hat über 800 Bilder und eine Beobachtungszeit von 5 Tagen, insgesamt 190 MB. Falls Interesse besteht, kann ich diese natürlich auch gerne hochladen, das dauert aber ein paar Stunden. Aufgenommen ist bei einer 63er Vergrößerung, angezeigt wird ein mittlerer Bildausschnitt. Nach ca 24 Stunden läßt die Bildaktivität merklich nach und nach und nach erstarrt das ganze Bild. Das Endstadium nach 5 Tagen, so wie ich es regelmäßig gesehen habe, sieht in etwas so aus:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/25637_4708819.jpg)
Meines Erachtens nach handelt es sich um mehr, als reine Molekularbewegung und physikalische Effekte, abschließend beweisen kann ich das bislang nicht. Was meinen Sie dazu?
Viele Grüße
mjk
ZitatMeines Erachtens nach handelt es sich um mehr, als reine Molekularbewegung und physikalische Effekte, abschließend beweisen kann ich das bislang nicht. Was meinen Sie dazu?
Ich habe mir nur den ersten "Film" intensiver angeschaut. Es ist immer dieselbe "Bewegung", die sich ständig wiederholt, kein einziges Bilddetail zeigt irgendeine Ortsbewegung. Das jeweils übernächste Bild wiederholt in allen Einzelheiten die Positionen. Es ist nicht die geringste Art von Bewegung zu erkennen. Die Strukturdetails bleiben über die gesamte Bildstrecke völlig unverändert
Haben Sie bei der Aufnahme irgendeinen Motor laufen gehabt? Die Aufnahme vermittelt mir den Eindruck als würde sich die gesamte Apparatur nach jedem Bild in der Höhe verstellen (Entfernung Objektiv:Präparat), aber alle zwei Bilder nacheinander wiederholen.
Da scheint mir etwas mechanisch nicht in Ordnung zu sein.
Mich würde mal interessieren, wie "Blutplasma" unter dem Mikroskop studiert werden kann, ohne dass die Zellen zerstört werden. Da Plasma gerinnt,
müßte man gerinnungshemmende Substanzen beifügen, die dazu verwendeten Substanzen sind pH-aktiv, verändern also das Präparat wesentlich.
Entnommenes Blut, das man auf einen Objektträger aus Glas bringt: Wie lange lebt das denn? Ich denke, daß es binnen 28 bis 32 sec koaguliert. Danach rührt sich darin doch wohl nichts mehr. Wissen Sie näheres? (Ich bin weder Mediziner noch Biologe, noch war Blut eines meiner Mikro-Steckenpferde.) Doch ich möchte aufgrund der rhythmischen, nach jeweils zwei Aufnahmen ständig wiederholenden Aufnahmen bezweifeln, daß die Aufnahmen irgendeinen realen Sinn ergeben. Könnte es sein, daß die verwendete Software ständig die beiden ersten Aufnahmen wiederholt?
Der zweite Link, dessen Datei ich ebenfalls heruntergeladen habe, läuft bei mir bei jedem Versuch nur nur 4 sec. Das ist zu wenig zum Beobachten.
Beim dritten Link habe ich den Eindruck mehrerer, zum Teil recht unterschiedlicher Bewegungen. Doch will ich das nicht jetzt gewichten, sondern erst wenn die Merkwürdigkeiten des ersten aufgeklärt sind.
Bin skeptisch.
Schöne Freitagsabendgrüße!
KH
Hallo -
erst eine IT-Frage: Kann man die Bildsequenzen als Einzelbilder hintereinander betrachten? Bei mir läuft das wie ein Film ab und ich kann das Programm danach nur per Dreifingergriff mit dem Task-Manager wieder vom Schirm bekommen.
Trotzdem - nach dem was ich gesehen habe, frage ich mich zunächst, ob sich da im Dunkelfeld überhaupt noch was an der Auflösung verbessern läßt.
Zur weiteren Diskussion wäre die Schichtdicke und etwas mehr über die "Untersuchungskammer" interessant und was außer den Thrombos noch im Serum enthalten ist (O2, CO2, ATP ....).
Ein schlichter Versuch wäre, die ganze Sache schnell und strukturschonend zu fixieren (z.B. Osmiumtetroxid). Die Protozoen-Strukturforscher machen das z.B. mit den Pseudopodien von Actinophryis und das sind sehr zarte Gebilde. Dann der Vergleich im Mikroskop: Wimmeln die Fixierten nun nicht mehr?
Ich glaube der Aufwand lohnt sich, weil es scheint, dass man auch aus den Artefakten noch Erkenntnisgewinn ziehen könnte.
Gruß
RB
Lieber Herr Henkel, lieber Herr Reblaus,
vielen Dank für Ihre kritischen Anmerkungen!
Zuerst zur Frage der Bildgewinnung und Software:
Ich habe die Bilder damals (oben rechts ist der November 2005 als Aufnahmedatum angezeigt) mittel eines undulierenden Z-Triebes aufgenommen, der in kleinsten Schritten sinusförmig um einen Mittelpunkt kreist. Ich habe dann automatisch alle 30 Sekunden ein Bild aufgenommen und das ganze einfach laufen lassen. Alle paar Stunden habe ich durchs Okular geschaut und nachgestellt, das erklärt die ruckhaften Veränderungen in der langen Sequenz.
Jetzt habe ich also 807 Einzelbilder als JPG vorliegen (ein ungünstiges Format, das habe ich zwischenzeitlich auf RAW geändert). Mit IrfanView kann man sog. Slideshows erstellen. Man lädt alle Bilder in einen Stack, gibt die Zeit für den Sprung zur nächsten Datei an (aktuell 0,01 s) und es wird einem eine exe-Datei, wie die bereitgestellten, erzeugt. Man erhält dann aus den Einzelbildern einen Zeitrafferfilm, den man nicht weiter bearbeiten kann.
Ich wollte gestern erst die ganze Sequenz hochladen, habe dann erst gesehen, uups 190 MB, da wird sich keiner freuen. Habe dann kürzere Sequenzen erstellt, die einzig wirklich zumutbare Dateigröße von 1,3 MB hat dann auch nur insgesamt 5 Bilder (wie der Dateinamen auch sagt). Ich habe hierzu aus der ersten halben Stunde jeweils ca jedes 10. Bild genommen und in den Stack eingefügt. Die Schleife ist auf loop gestellt, weil 5 Bilder ja sofort vorbei sind. Ich wollte hiermit eigentlich nur Ihr Interesse und die Neugier an dem Download einer größeren Datei wecken. Den Film beenden kann man jederzeit mit der Escape-Taste. Ich würde Ihnen und jedem anderen Interessierten gerne eine CD mit den Originalbildern und ggf. einer Slideshow brennen und zuschicken, damit Sie sich ein eigenes Bild machen können. Die 807 Einzelbilder von dieser Untersuchung haben einen Gesamtdateigröße von 529 MB.
Zur Präparation und Haltbarkeit von Blut nach der Abnahme:
Ich hatte weiter oben erwähnt, daß ich mit Natrium-Citrat versetztes Blut verwende. Natrium-Citrat bindet die Gerinnungsfaktoren und macht das Blut ungerinnbar. Es beeinflusst aber nicht die Thrombozytenfunktion. Blut kann nur durch ein Zusammenwirken von Gerinnungsfaktoren und Thrombozyten gerinnen. Störungen des einen wie des anderen System führen in vivo zu einer gesteigerten oder verminderten Gerinnungsfunktion (z.B. Faktor-V-Leiden, Hämophilie, Thrombozytopenien, Thrombozytopathien usw. stellen alle schwere Gerinnungsstörungen dar, die zu einer erhöhten Thromboseneigung auf der einen Seite oder einer erhöhten Blutungsneigung auf der anderen Seite führen).
Wir arbeiten mit sog. PRP, d.h. Platelet Rich Plasma (=Thrombozytenreiches Plasma). Da ich meinen ganzen finanziellen Wagemut zusammengenommen habe und auf dieses Verfahren erst kürzlich ein Patent angemeldet habe, dessen Anmeldung noch nicht vollständig abgeschlossen ist, möchte ich die einzelnen Präparationsschritte hier (im Internet) nicht schriftlich darlegen, ich werde Sie aber Ihnen und jedem anderen, der interessiert ist, gerne telefonisch erläutern. Und natürlich würde ich mich freuen, jedem Interessierten das ganze auch einmal Live zu demonstrieren. Auf meiner Webseite http://www.mjkraus.de finden Sie alle Kontaktdaten. Ich habe diese Woche Bereitschaftsdienst, Sie können mich jederzeit erreichen. Nur Schriftliches ist hier nicht so gut, da die Präparation einer der Kernpunkte der ganzen Geschichte ist.
Ich arbeite letztlich also mit einer Thrombozytenkultur, in der die Thrombozyten tatsächlich über einige Tage überleben.
PH und Ionenkonzentrationen spielen eine bedeutende Rolle. Das Citratblut ist deshalb auch gepuffert und hält den pH weitgehend konstant. Das ist übrigens nicht auf meinem Mist gewachsen sonder ein durchaus übliches Präparationsverfahren für Thrombozyten. Nur daß praktisch alle sonstigen Untersuchungsverfahren den Thrombozyten dann zu einem bestimmten Zeitpunkt fixieren und in dann meistens elektronenmikroskopisch darstellen.
Natürlich spielen auch die anderen Plasmabestandteile eine Rolle, ich habe eine ganze Weile lang eine komplette Serumuntersuchung mitlaufen lassen, da scheint vieles eine Rolle zu spielen: Zuckergehalt, Cholesterin, Natrium, Kalium, Calcium, auf jeden Fall ATP usw. Aber mir fehlt ja ein effizientes Quantifizierungssystem um diese ganzen Effekte nach und nach sinnvoll zu dokumentieren, deshalb bin ich ja letztlich hier.
Zur Bewegung
Mich interessiert primär die Beweglichkeit und das Wachstum der Thrombozytenfortsätze. Direkt nach Präparation kann man praktisch nur Thrombozyten in Scheibchenform, ohne Fortsätze sehen. Nach einer gewissen Lagerungszeit von z.B. 2 Stunden haben sich die meisten Thrombos abgesenkt und werden vermutlich durch die Aktivierung mit Glas (das legen zumindest die Untersuchen von Breddin et al. aus den 70er und 80er Jahren nahe) aktiviert. Der thrombozytäre Formwandel (sog. Shape-Change) ist ein ziemlich heiß diskutiertes Thema und bei weitem nicht abschließend geklärt. Es gibt aber auch in-vivo Untersuchungen, bzw. Untersuchungen an Gefäßmodellen in der Flow-Chamber, die ein entsprechendes Thrombozytenverhalten zeigen.
Zur Fixation
Können Sie mir hierzu näheres sagen, wie die Fixation z.B. mit Osmiumtetroxid funktioniert? Ich habe ja das Problem, daß die Effekte sich erst im Präparat/in der Kultur zu entwickeln scheinen. Ich hatte an so etwas wie ein Schockgefrieren oder ähnliches gedacht, bin hier aber noch nicht voran gekommen.
Viele Grüße
mjk