Ersuchen um konkrete Vor-Ort-Hilfe Mikrophotographie südl. von München

[xammax]

Hallo,

vielen Dank für die vielen Anregungen! Bitte entschuldigen Sie die unvollständigen Angaben zu den Bildern und meines System.



Thrombozyten sind der kleinste zelluläre Bestandteil des Blutes. Sie besitzen keinen eigenen Zellkern, sondern sind Abschnürungen von Zytoplasma aus sog. Megakaryozyten im Knochenmark. Thrombozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung, Aspirin wirkt zum Beispiel über eine Hemmung der Thrombozytenfunktion.

Wenn die Thrombozyten mit Glas in Berührung kommen, werden sie aktiviert. Das Zytoplasma stülpt sich aus, es werden Fortsätze gebildet, die zum Teil eine sehr erhebliche Länge und Menge bekommen können.
Wenn die Thrombozyten nun in meinem nach einem bestimmten Verfahren angelegten Präparat sich gegen das Objektglas absenken, werden sie langsam aktiviert. Man kann im Dunkelfeld recht genau beobachten, wie sich dieser Aktivierungsvorgang abspielt, wie die Fortsätze sich ausbilden, bewegen, langsam anhaften und der Thromboyzt dann nach einer Weile vollständig erstarrt.

Mir geht es jetzt um eine Objektivierung und Quantifizierung dieses Aktivierungsvorganges. Ich möchte hierzu die Anzahl, Länge und Breite der Fortsätze bestimmen.
Ein Thrombozyt ist durchschnittlich ca 2,5 µm breit, er bildet zwischen 1 und ca 50 Fortsätzen, die Fortsätze sind ca 0,5 bis 5 µm lang und haben eine Breite von ca 0,2 - 0,4 µm. Ich habe händisch schon eine ganze Reihe von Thrombozytenfortsätzen ausgezählt, das funktioniert ganz gut und dafür reicht auch die Qualität der Aufnahmen. Das dauert aber ewig und ist keinesfalls praxistauglich. Die Bilder sind wohl aber nach Auskunft von Experten in der automatischen Auswertung, für eine solche nicht scharf und kontrastiert genug. Das will ich jetzt verbessern, so es irgendwie möglich ist.

Da ich Foto-technisch ein echter Stümper bin, bin ich nach wie vor sicher, daß ich von Ihnen allen eine Menge wertvolle und hilfreiche Informationen bekommen könnte, um das ganze einfach besser hinzukriegen.

Ich arbeite zur Zeit mit folgendem Aufbau (schriftliche Details folgen weiter unten):





Mikroskop:
Wild Leitz GMBH
Type 020-505.030
512859/105428
110/120-130/220-230/240-250V~
IC 280
50-60 Hz  P max. 30W  Birne 6V 20W
Made by Leitz Portugal

Lampenhaus:
Leitz Wetzlar Germany
Type 307-150.001  514 725
Birne 12V max. 100W

Halogenbirne:
Narva Plauen made in GDR
HLWS 5-A
12 V 100 W
Py 24-1,5
Lichtwurflampe mit Justiersockel

Trafo:
Made in Switzerland by OMAG
for
WILD HEERBRUGG AG and
ERNST LEITZ WETZLAR GmbH
Type MTR 27
0-12V~
Total max 100W

Dunkelfeldkondensor:
LEITZ WETZLAR GERMANY
513 547
D 1.19-1.44 OEL S11

Objektiv: (benutze ich üblicherweise)
Olympus Japan 100
A 100
1.30 oil
160/0.17

Objektiv-Alternative 1:
Carl-Zeiss Jena 844419
Apochromat
HI 100/1,32
160/0,17

Objektiv-Alternative 2:
519848
Leitz Wetzlar Germany
*160/0,17
PL Fluotar
100/1,32-060 Oil

C-Mount:
0,63X
1/2"=11.6
2/3"=17,5

C-Mount-Alternative:
0,5x:
1/2 Zoll = 16

Kamera alt (und leider kaputt):
Canon Powershot A95 angeschlossen an PC über USB

Kamera neu:
Leica DFC 295 angeschlossen an PC über Firewire


Der komische Holzkasten links neben dem Mikroskop ist ein Elektromotor, der den Z-Trieb automatisiert/automatisieren kann.

So, ich hoffe, ich habe alle notwendigen Daten vollständig erfasst und konnte meine Absichten klar machen.
Vielen Dank für alle Unterstützung!

Max-Joseph Kraus

[xammax]

Was ich aus dem mittleren Bild deutlich erkenne, ist dass die Kamera falsch adaptiert ist. Das wundert mich auch nicht, denn die Axiocam fordert ein auskorrigiertes Zwischenbild, was Ihr Laborlux nicht bietet, wenn, was ich annehme, Sie diese Kamera ohne Okular/Projektiv betreiben.

Im Übrigen habe ich das Problem, dass ich mit den Strukturen absolut nichts anfangen kann - kenne sie nicht. Ein Maßstab würde sicherlich helfen. Sollten sie wirklich in der angegebenen Größenordnung liegen, wären die Fotos fantastisch und verlangten eine gewisse Nachbereitung mit Photoshop oder Gimp o.ä.

Also, aus der Ferne dürfte Hilfe schwierig sein, aber vielleicht nicht unmöglich?!

Hallo Herr Kramer,
die eingestellten Bilder sind noch mit der Canon Powershot A95 aufgenommen. Ich habe gerade nochmal alle Daten gepostet und dabei festgestellt, daß es sich gar nicht um eine Zeiss Axiocam sondern um eine Leica DFC 295 handelt. Habe die Kamera erst kürzlich bekommen und bin mit deren optimaler Einstellung sowieso noch reichlich überfordert. Wie muss ich das mit dem auskorrigierten Zwischenbild verstehen??? Was könnte ich da tun?

Die Hilfe aus der Ferne läßt sich gut an! Ich bin optimistisch!
Danke!
Max-Joseph Kraus

[TPL]

Wenn die Thrombozyten mit Glas in Berührung kommen, werden sie aktiviert. Das Zytoplasma stülpt sich aus, es werden Fortsätze gebildet, die zum Teil eine sehr erhebliche Länge und Menge bekommen können.

Hallo Herr Kraus,
ich bin völlig fachfremd und medizinisch unbedarft, aber ich meine mich zu erinnern, dass für solche Objekte (lebendige, extrem dünne und schwach absorbierende Körper auf Glassubstrat) bei Leitz der Reflexionskontrast (bei Zeiss: Antiflex-Methode) entwickelt wurde. Zur biomedizinischen Anwendung dieser Methode gibt es hier im Forum einen sehr profunden Kenner, dessen Beitrag Sie hier finden: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=1356.msg7191#msg7191.

Wenn ich es recht verstanden habe gibt es hier im Gegensatz zum Dunkelfeld-Kontrast keine Einbuße bei der Auflösung, da die Apertur nicht verringert werden muss.
Viel Erfolg!

[xammax]

... Das erste Foto zeigt mir den Thromcoyten so, wie ich ihn auch ( z.B. von EM-Aufnahmen ) kenne, mit den beiden weiteren Bildern kann ich auch nicht wirklich etwas anfangen. Ich finde sie aber erstaunlich "gelungen" und kann mir nicht vorstellen, dass Sie mit konventionellen lichtmikroskopischen Methoden und einer "hobbymäßig" bezahlbaren Ausrüstung zu ( noch ) besseren Ergebnissen kommen können.

Hallo Herr Voigt,
Die anderen Bilder zeigen auch Thrombozyten nach Aktivierung durch Glas. Die Beobachtung dieser Aktivierungsvorgänge ist (für mich) wirklich hochgradig faszinierend, ich habe zwischenzeitlich zigtausende von Bildern, die eingestellten Aufnahen sind natürlich besonders gelungen. Ich habe zeitliche Folgen über mehrere Tage aufgenommen, die Dynamik, die in diesen Präparaten herrscht, ist einfach nur faszinierend. WUNDER NATUR!!!
Ich hoffe doch, daß es besser geht!
Vielen Dank für Ihre Worte!
Max-Joseph Kraus

[xammax]

... ich (Labormediziner am Hygieneinstitut Krefeld) finde Ihre Aufnahmen schon sehr gut. Ein wichtiges Problem sind sicherlich Unschärfen durch Erschütterungen beim Auslösen der Kamera und die Brownsche Molekularbewegung, wenn sie an suspendierten, frischen Thrombozyten arbeiten. Ist ein Arbeiten an fixierten Präparaten möglich? Eventuell kann die Fluoreszenzmikroskopie weiterhelfen. Mich interessiert sehr was Sie darstellen möchten, was ist der Zweck Ihrer Untersuchung? und mit welchen Präparaten arbeiten Sie? (Antikoaggulanz, buffy-coat?).

Hallo Herr Feller,

ich habe zwischenzeitlich in meiner Antwort mit der Angabe der ganzen Mikroskopdaten schon näheres zu meinen Absichte geschrieben.
Ich benutze einfaches Citratblut (3,2 %, Natrium-gepuffert, 0,105 Molar). Meine kurzfristige Absicht ist, die Aktivierungsvorgänge, die ich schon seit Jahren im Dunkelfeld beobachte, in objektive Zahlen zu fassen. Ich möchte dann untersuchen/nachweisen, daß das so dargestellte Aktivierungsverhalten der Thrombozyten medikamentös beeinflusst werden kann (Stichwort: ASS-Resistenz). Ein zweiter längerfristiger Ansatzpunkt ist, daß es Hinweise gibt, daß die morphologischen Unterschiede im Aktivierungsverhalten, also die Form der Fortsätze, auf das Bestehen/die Anlage verschiedener Krankheiten hinweisen kann (z.B. Diabetes). Diese Aussage möchte ich gerne nachweisen oder widerlegen.
Ich brauche hierfür aber unbedingt ein praktikables Verfahren, daß mir schnell meine Beobachtungen in Zahlen umsetzt. Ich habe deshalb schon Kontakt zu verschiedenen Bildbearbeitern aufgenommen, diese fordern aber widerum schärfere, kontrastreichere Bilder.
Fixierte Präparate gehen leider nicht, die Lebendzellbeobachtung ist sozusagen gerade der Clou an der ganzen Geschichte.
Die Leica-Kamera macht jetzt praktisch keine Auslösebewegungen mehr, ich hoffe auch, daß das schon etwas bessert.

Vielen Dank für Ihr Interesse und Ihre freundlichen Worte.
Max-Joseph Kraus

[Eckhard]

Hallo Herr Kraus,

als allererste Massnahme würde ich den PC vom Regal nehmen. Festplatte und Lüfter bringen Vibrationen ins Spiel.

Dann würde ich die Kameraadaption testen. Objektträger mit mm Skala drunter und aufnehmen. Nicht nur mit dem 100x sondern die ganze Objektivreihe. Eine fehlerhafte Adaption ist auf den resultierenden Bildern erkennbar.

Wenn die Adaption in Ordnung ist würde ich mit einem Diatomeen Testpräparat Dunkelfeldaufnahmen machen. Wenn diese auch OK sind - dann können sie davon ausgehen, dass Ihr Setup in Ordnung ist.

Aber ich glaube, auf dem Weg werden Sie die eine oder andere Überraschung erleben.

Herzliche Grüsse
Eckhard Völcker

[xammax]

Hallo Herr Kraus,

als allererste Massnahme würde ich den PC vom Regal nehmen. Festplatte und Lüfter bringen Vibrationen ins Spiel.

Dann würde ich die Kameraadaption testen. Objektträger mit mm Skala drunter und aufnehmen. Nicht nur mit dem 100x sondern die ganze Objektivreihe. Eine fehlerhafte Adaption ist auf den resultierenden Bildern erkennbar.

Wenn die Adaption in Ordnung ist würde ich mit einem Diatomeen Testpräparat Dunkelfeldaufnahmen machen. Wenn diese auch OK sind - dann können sie davon ausgehen, dass Ihr Setup in Ordnung ist.

Aber ich glaube, auf dem Weg werden Sie die eine oder andere Überraschung erleben.

Herzliche Grüsse
Eckhard Völcker

Hallo Herr Völcker,

vielen Dank für diese konkreten Hinweise. Wie macht man ein Diatomeen Testpräparat? Oder sollte ich das irgendwo kaufen?

Viele Grüße
Max-Joseph Kraus

[Eckhard]

Hallo Herr Kraus,

für Diatomeen Testpräparate sprechen Sie einfach Herrn Dr. Ralf Nötzel aus diesem Forum an. Sagen Sie ihm welche Auflösung Sie für Ihre Untersuchungen anstreben. Er kann Sie sicherlich beraten welche Präparate für Sie in Frage kommen.

Herzliche Grüsse
Eckhard Völcker

[Detlef Kramer]

Hallo Herr Kraus,

ich gebe Eckhard Völcker recht, dass Sie wahrscheinlich noch einen längeren Weg vor sich haben. Aber so schlecht sieht die Sache doch nicht aus und das letzte Foto ist eigentlich schon beeindruckend.

Zur automatischen Analyse bräuchte man bei solchen Fotos eigentlich nur eine Art Zweiton-Isohelie zu machen. D.h. man hebt den Kontrast so stark an, dass nur noch schwarz und weiß übrig bleiben und legt die Schwelle mit dem Helligkeitsregler so, dass der Übergang Schwarz/Weiß an der richtigen Stelle liegt. Das kann jedes Bildbearbeitungsprogramm. Am besten wäre es, Sie fänden jemand, der sich mit ImageJ auskennt. Damit geht das alles und auch die Auswertung. Mit diesem Programm könnte man die Analyse sogar automatisieren, entweder mit einem der in die Tausende gehenden Scripte (plug-ins) oder indem man ein spezielles Script schreibt. Ich bin dazu zu alt und zu doof, aber es soll nicht schwer sein. Eventuell geht das Ganze sogar mit der Software, die der Kamera beigelegen hat.

Zum auskorrigierten Zwischenbild: Fast alle Mikroskopobjektive aus der Endlich-Zeit, die von Leitz gehören dazu, sind mit bestimmten Fehlern behaftet, die von den Okularen kompensiert werden müssen. Projeziert man das Zwischenbild ohne ein solches kompensierendes Okular (resp. Projektiv) direkt auf den Chip, findet man diese Fehler natürlich im Bild wieder. In Ihrem Fall bin ich mir da aber nicht sicher, da wir jetzt wissen, dass die Kamera von Leica ist. Dieses System kenne ich nicht und es kann sein, dass da eine kompensierende Optik integriert ist. Das müsste man klären. Die ganze Einschränkung gilt aber sowieso nicht für Strukturen in der Bildmitte.

Also ich denke, die Probleme sind lösbar.

Beste Grüße

Detlef Kramer

[reblaus]

Hallo -
Sie schreiben, dass Ihr Lieblingsobjektiv das Olympus 100 ist - ergänzend zum Vorredner wollte ich deshalb noch auf dessen eigene interessanten Untersuchungen hinweisen:
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=3697.0. Allerdings spielt dies, wie gesagt, in der Bildmitte kaum eine Rolle, höchstens als Farbsäume an Strukturen, die außerhalb der Schärfeebene liegen (ich glaube, das sieht man auf Ihrem Foto).
Zu berücksichtigen ist allerdings auch, dass Ihre Präparate wohl relativ dick sein müssen, wenn Sie das Absinken der Ts. auf das Glas beobachten und sich wohl eine Serumschicht zwischen Objekt und Deckglas befindet, welche optisch ungünstig ist.
Selbst bin ich von dem Phänomen auch betroffen, dass meine Photos von Blutausstrichen mit dem 100er Öl (in diesem Falle Durchlicht mit einem Zeiss Planapo) nicht so scharf wirken, wie sie mir durchs Okular erscheinen. Dass aber Thrombos so groß werden können war mir als Halblaien auf diesem Gebiet auch neu - stimmt der 5µ Maßbalken tatsächlich?
Ansonsten drücke ich für Ihre Arbeit die Daumen, nachdem ich mich (wie wohl andere Forumsteilnehmer) davon überzeugen konnte, dass diese nichts mit der üblichen Artefaktkunde von Dunkelfeld-Blutmikroskopikern zu tun hat.
Freundliche Grüße
RB

[wilfried48]

Hallo,

für Höchstauflösung ist hier im Forum eigentlich  Herr Höbel zuständig, aber da er sich nicht meldet werde auch ich noch meinen "Senf" dazugeben.

Da die Farbinformation offensichtlich nicht notwendig ist könnte man, falls die nicht CVD korrigiert angepasste Kamera stört, mit einem Interferenzfilter monochromatisch im blauen Licht beleuchten. Dann schlägt die  CVD nicht zu und man hat durch die kleinere Wellenlänge noch eine Auflösungsverbesserung. Eventuell könnte man, wie Herr Höbel, sogar noch mit einer UV - LED beleuchten und nochmal Auflösung/Kontrast gewinnen falls die Lebendpräparation das aushält.

hochauflösende Grüsse

Wilfried

[Peter V.]

Hallo!

mal ein banale Frage zu Darstellung: Bin ich deer Einzige, der nicht alle Bilder Ihres beitrages, in welchen Sie Ihre Ausrünstung zeigen, sehen kann? Von den jeweils rechten Bildern sehe ich mit meinen beiden verschiedenen Browsern nur einen kleinen Teil.

Ansonsten bin ich übrigens auch erfreut, dass die Darstellung Ihres Vorhabens gezeigt hat, dass es sich hier nicht -wie von mir initial befürchtet - um eine weitere esoterische Spielart von "Enderlein" handelt.

Herzliche Grüße
Peter

[Detlef Kramer]

Lieber Peter,

Herr Kraus hat nur die Fotos zu groß gemacht. Wenn Du ganz runter gehst in der Seite findest Du den horizontalen Scroller (oder, wie immer man das Ding nennt). Schieb den nach rechts und Du siehst alles.

Gruß

Detlef

[Peter V.]

Lieber Detlef,

mit dem Scrollbalken ist nichts zu machen. Aber ich habe die Bilder nun gesehen, indem ich die Schriftdarstellung im IE einfach skaliert habe. Allerdings ist dann die Schrift unlesbar. Aber man kann halt nicht alles gleichzeitig haben ( außer vielleicht Du, als Macianer ).

Herzliche Grüße
Peter

[Detlef Kramer]

Nein,

das hat nichts mit Mac oder Windoof zu tun: Verabschiede Dich endlich von dem IE. Lad Dir den kostenlosen Firefox runter und Du bist alle Probleme los!

Herzliche Gute Nacht-Grüße

Detlef