Liebes Forum,
motiviert durch einen älteren Beitrag von Alf (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=39518.0 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=39518.0)) habe ich mir den Brombeerrost an den Brombeerpflanzen im Garten unter dem Mikroskop genauer angeschaut. Eingezwängt zwischen Brennesseln und diversen Sträuchern haben sich (Abbildung 1) ein paar Brombeerpflanzen etabliert, die aufgrund der halbschattigen Lage leider keine süßen Früchte tragen. Aber die Insekten lieben die Brombeerblüten, und die Vögel nutzen das dornige Gebüsch gerne als Versteck. Deshalb dürfen die wuchernden Brombeeren bleiben. Die Pflanzen werden jedes Jahr zuverlässig vom Brombeerrost befallen (Abbildung 2), Probenmaterial ist also genug vorhanden.
Die Verbreitung des Brombeerrostes erfolgt über Sporen, von denen es im Jahresverlauf mehrere Formen gibt (https://www.bedlan.at/media/Schadbilder/Obst/Brombeere_Rost.pdf (https://www.bedlan.at/media/Schadbilder/Obst/Brombeere_Rost.pdf)): Im Frühjahr bilden sich aus den Wintersporen (Teleutosporen) erste Basidiosporen, welche die frischen Brombeertriebe infizieren, und in weiterer Folge kommt es zur Bildung der Frühjahrssporen (Äzidien, Spermogonien).
An der Oberseite der Brombeerblätter ist der Befall durch violett-bräunliche Flecken (Abbildung 3) erkennbar. Im weiteren Verlauf bilden sich an der Blattunterseite gelblich-orange Sommersporen (Uredosporen) und im Spätsommer dann schwarze Wintersporen (Teleutosporen), die der kalten Witterung im Herbst und Winter widerstehen können und im folgenden Frühjahr (siehe oben) den Zyklus wiederholen.
Manchmal findet man Sommer- und Wintersporen an derselben Stelle, siehe z.B. Abbildung 4.
Die schwarzen Teleutosporen (Abb.5, z-Stack im Stereomikroskop) bestehen aus meistens 4 Segmenten, einem Stiel und einer Papille an der Spitze. Die Sporen sind recht groß, wie in Abb. 6 zu erkennen ist (Hellfeldaufnahme im Durchlichtmikroskop mit 100x Objektiv).
Die Sommersporen (Uredosporen) sind in Abb. 7, wiederum als z-Stack im Stereomikroskop, gezeigt. Im Durchlichtmikroskop (Abb. 8, DIC-Aufnahme im Durchlicht mit 100x-Objektiv) erkennt man die warzige Oberfläche und die Größe, die typischerweise bei ca. 20µm liegt.
Das eigentlich Ziel meiner "Rost-Studie" war die Herstellung von Paraffinschnitten, die mit Pianese-Färbung gefärbt werden sollten. Das Einbetten, Schneiden am Schlittenmikrotom sowie Färben nach Pianese hat soweit ganz gut funktioniert (Abb. 9, 10µm dicker Schnitt durch ein vom Brombeerrost befallenes Blatt). Man erkennt das grün gefärbte Blattgewebe, die rosa eingefärbten Hyphen des Rostes sowie den Fruchtkörper, in dem Sporen gebildet werden. Abb. 9-12 sind alle im Hellfeld aufgenommen, mit 10x-Objektiv (Abb. 9), 40x (Abb. 10) und 100x-Objektiv (Abb. 11 und 12).
Eigentlich wollte ich die Bildung der gelblichen Sommersporen dokumentieren, das ist offenbar nicht gelungen, da von den recht großen (20µm) Sporen nichts zu sehen ist, siehe Abb. 10, 11 und 12. Die Blätter habe ich Mitte Juni entnommen, eventuell habe ich die Bildung von Frühjarssporen dokumentiert? Die Sporen in Abb. 11 und 12 sind deutlich kleiner als 20µm, ich habe Größen von ca. 4-5µm gemessen. Vielleicht kann mir da jemand weiterhelfen und erklären, was genau in den gezeigten Paraffinschnitten zu sehen ist.
LG
Jürgen
Hach, der Brombeerrost....
den hab ich reichlich; vor allem an den alten Ästen. Kommt auch jedes Jahr mit schöner Regelmäßigkeit wieder. Hat aber den Früchten bisher nicht geschadet.
ich hab mal ein Bild mit dem 100er Phako gemacht.
Wolfgang
Zitat von: liftboy in August 04, 2022, 10:29:21 VORMITTAG
ich hab mal ein Bild mit dem 100er Phako gemacht.
Hallo Wolfgang,
gelungenes Bild, die Warzen an der Oberfläche kommen da bestens zur Geltung!
LG
Jürgen
Sehr Interessant!
Hallo Jürgen,
sehr schöne und gründliche Dokumentation.
Gruß Heiko
Hallo Tommy und Heiko,
danke für Eure Rückmeldungen! Ich werde am Thema dranbleiben, die Frühjahrssporen geben mir schon noch etwas Rätsel auf. Ich fürchte, bis zum kommenden Frühjahr warten, um dann etwas genauer hinschauen zu können.
LG
Jürgen
Hallo Jürgen,
inwiefern bekümmern dich die Uredosporen? Bestimmungsrelevant(er) sind doch jedenfalls die Teleutosporen – und die sprechen wirklich sehr für P. violaceum.
Viele Grüße,
Heiko
Hallo Jürgen,
nur so eine Idee eines Nichtpilzers: Kann es vielleicht sein, dass die zu kleinen Sporen in den Schnitten einfach noch nicht reif sind und noch wachsen würden oder durch die Präparation geschrumpft sind?
LG Gerd
Hallo Gerd,
da hast Du sicher recht! Ich hab auch Präparate in wasserfreien Einschlußmedien (Eukitt, Euparal), da sehen die auch ganz anders aus.
Zitat von: Heiko in August 06, 2022, 22:43:13 NACHMITTAGS
inwiefern bekümmern dich die Uredosporen? Bestimmungsrelevant(er) sind doch jedenfalls die Teleutosporen – und die sprechen wirklich sehr für P. violaceum.
Hallo Heiko,
die Bestimmung steht für mich auch außer Zweifel. Ich würde nur gerne wissen, was in den Paraffinschnitten zu sehen ist, mehr aus Neugier denn aus Zweifeln, ob es sich um Brombeerrost handelt.
Zitat von: plaenerdd in August 07, 2022, 10:53:02 VORMITTAG
nur so eine Idee eines Nichtpilzers: Kann es vielleicht sein, dass die zu kleinen Sporen in den Schnitten einfach noch nicht reif sind und noch wachsen würden oder durch die Präparation geschrumpft sind?
Hallo Gerd,
bin auch Nicht-Pilzler. Aber Schrumpfen oder Wachsen von Sporen in dieser Größenordnung kann ich mir nicht wirklich vorstellen. Die Uredosporen sind ca. 20µm groß, die vermeintlichen Frühjahrssporen ca. 5µm, d.h. das Volumen unterscheidet sich um den Faktor 64, da muss es sich in meinen Augen schon um etwas anderes handeln.
Zitat von: liftboy in August 07, 2022, 15:56:55 NACHMITTAGS
da hast Du sicher recht! Ich hab auch Präparate in wasserfreien Einschlußmedien (Eukitt, Euparal), da sehen die auch ganz anders aus.
Hallo Wolfgang,
da bräuchten wir noch einen Skalierungsbalken/Vergrößerung, hast Du das eventuell noch parat?
LG
Jürgen
Hallo Jürgen,
ich meinte, Du zögest auch P. bulbosum in Betracht ...
Nun, Blattoberseite und etwa 5 µm, da hast Du die Spermogonien also die 0-Sporen erwischt.
Viele Grüße,
Heiko
Nun fehlen Dir noch die I-Sporen, siehe hier: http://www.pilzflora-ehingen.de/pilzflora/arthtml/prubi.php
Gruß, Heiko
Zitat von: Heiko in August 08, 2022, 21:46:03 NACHMITTAGS
Nun fehlen Dir noch die I-Sporen, siehe hier: http://www.pilzflora-ehingen.de/pilzflora/arthtml/prubi.php
Gruß, Heiko
Hallo Heiko,
danke für die Erläuterungen und den Link. Da habe ich dann gleich ein kleines Projekt für die kommende Saison, mit dem Ziel, die fehlenden Sporenformen ebenfalls zu dokumentieren.
LG
Jürgen
Hallo Jürgen,
Zitatda bräuchten wir noch einen Skalierungsbalken/Vergrößerung, hast Du das eventuell noch parat?
wenn Du scharf aufs Foto siehst, ist unten ein roter Strich; Länge 100µ (ich geb zu, der ist schwer zu sehen), hab dann noch mal in meiner Datenbank nachgesehen: ~12-23µ°
Grüße
Wolfgang
Wenn es in Richtung Spätherbst geht, wird es etwas knapper mit botanischem Probenmaterial. Da sind die Konidien, die als Wintersporen dafür sorgen, dass der Brombeerrost im nächsten Frühjahr wieder keimen kann, ein willkommenes Untersuchungsobjekt.
Hier kommt ein Versuch, ein Sporenlager am Rasterelektronenmikroskop aufzunehmen. Abb. 14 zeigt eine Originalaufnahme der zahlreichen Sporen. Abb. 13 einen weiteren Ausschnitt aus einem Sporenlager, coloriert in Photoshop. Die filzigen Haare des Brombeerblattes habe ich grün eingefärbt, die Sporenköpfe in einem Braunton, der an die ursprüngliche Farbe erinnern soll.
LG
Jürgen
Großes Kompliment.
Gruß, Heiko
Super Jürgen!
Ich will auch ein REM...
Grüße, Thomas.
Hallo Heiko und Thomas,
danke für das Lob!
Die Bildkontraste in Kombination mit der hohen Tiefenschärfe, die mit dem REM möglich sind, ergeben ohne großen Aufwand schöne Aufnahmen. Mit der Colorierung werde ich mich noch intensiver beschäftigen, das bringt dann noch einmal einiges an Attraktivität.
LG
Jürgen
Lieber Jürgen,
Darf ich dich fragen, wie du dieses Material fixiert und getrocknet hast?
Mit freundlichen Grüßen, René
Hallo René,
ich habe einfach mit dem Skalpell ein ca. 7x7mm² großes Stück aus einem Brombeerblatt ausgeschnitten und mit doppelseitig leitfähigem Klebeband auf einen Stiftprobenteller geklebt. Danach lag die Probe zum Trocknen ein paar Tage an Luft. Vor der Aufnahme ca. 90sec mit Gold besputtert, und dann ins REM gegeben.
LG
Jürgen
Das Leben kann so einfach sein...
Gut gemacht,
René
Der Frühling zieht ins Land, und der Brombeerrost beginnt sein Werk von Neuem. Aktuell keimen die Wintersporen (Teleutosporen) und bilden einzellige Basidiosporen auf Basidien (siehe https://www.bedlan.at/media/Schadbilder/Obst/Brombeere_Rost.pdf (https://www.bedlan.at/media/Schadbilder/Obst/Brombeere_Rost.pdf)). Im REM sind die keimenden Teleutosporen, die sich auf den Blättern des Vorjahres befinden, sehr gut zu erkennen.
Die abgebildeten Sporen infizieren in weiterer Folge die frischen Blätter des heurigen Jahres und bilden dort Frühjahrssporen. Mal schauen, ob ich die nächste Sporengeneration ebenfalls mikroskopisch dokumentieren kann.
LG
Jürgen
Anmerkung 12-2024: Ich vermute, dass es sich hier nicht um Basidiosporen handelt, sondern um eine andere Pilzinfektion auf den abgestorbenen Teliosporen.
Und hier das Ganze in Farbe, damit der verregnete Sonntag etwas bunter wird.
LG
Jürgen
Der Brombeerrost hält mich auf Trab.
Die im vorigen Post gezeigten Basidiosporen haben ihr Werk getan, indem sie auf den frischen Blättern der Brombeere ein neues Myzel gebildet haben. Diese neue Generation an Rostpilzen äußert sich durch abgestorbenes Blattgewebe an der Blattoberseite (siehe Abb. 1), in dessen Mitte Hyphen die 0-te Sporengeneration bilden.[1] Diese sogenannten Spermatien sind für die geschlechtliche Vermehrung des Pilzes verantwortlich. Abb. 2 zeigt das Spermogonium mit den sporentragenden Hyphen im Rasterelektronenmikroskop. Abb. 3 zeigt eine Detailaufnahme der Spermatien.
Interessanterweise habe ich nirgends eine Abbildung dieser (eigentlich in fast jedem Garten mit Brombeeren vorkommenden) 0-ten Generation der Sporen gefunden. Ich hoffe also, dass ich mit meiner Bestimmung richtig liege.
War die Befruchtung erfolgreich, dann bilden sich auf der Blattunterseite Aecidiosporen (Generation I), siehe folgender Post.
[1] M. Piepenbring, Mykologie, Springer Spektrum, 2022
Anmerkung 12-2024: Bei den Aufnahmen handelt es sich vermutlich um einen Hyperparasiten, der auf den Sporenlagern des Brombeerrostes wächst.
Die nächste Sporengeneration (Generation I: Aecidiosporen, welche im Aecidium gebildet werden) ist recht auffällig und mit freiem Auge gut erkennbar (Abb.4). Die knallgelben Sporenlager brechen an der Blattunterseite durch das Blattgewebe, um dort eine sehr große Zahl an Aecidiosporen zu bilden und in weiterer Folge freizusetzen.
Abb. 5 zeigt ein solches Sporenlager im Stereomikroskop. Im Rasterelektronenmikroskop (Abb. 6) wird noch deutlicher, wie das Sporenlager aus dem Blattinneren hervorquillt. Die einzelnen Sporen sind ca. 25µm groß. Im Lichtmikroskop (100x-Objektiv, Färbung mit Baumwollblau, siehe Abb.7) ist die warzige Oberfläche schon recht gut erkennbar. Noch deutlicher wird diese Oberflächenstrukturierung im REM, siehe Abb. 8.
LG
Jürgen
Der Brombeerrost hält mich weiterhin auf Trab, hier ein Paraffinschnitt durch ein Brombeerblatt (Querschnitt), an dem sich Aecidiosporen ausgebreitet haben (siehe voriger Post). Gefärbt habe ich mit Pianese-Färbung. Die Schnitte waren ca. 12-15µm dick, geschnitten am Reichert Schlittenmikrotom.
Normal sollte das Wirtsgewebe grün sein, bei der Differenzierung habe ich die Proben vermutlich zu lange in Ethanol/Essigsäure belassen und so das Grün verloren. Die Aufnahmen gefallen mir trotzdem, man erkennt gut das Aecidium mit den Sporen an der Blattunterseite sowie die Reste des Sporangiums an der Blattoberseite. Aufgenommen wurde das erste Bild mit einem 10x-Objektiv.
In der Detailaufnahme (zweites Bild, 100x Ölimmersion, Stack aus 5 Aufnahmen) werden die Details der Sporen sichtbar. Unter anderem sieht man die Ansätze der Warzen, die im REM-Bild (siehe voriges Posting) so deutlich hervortreten.
LG
Jürgen
Der Brombeerrost sorgt nach wie vor für ausreichend mikroskopische Beschäftigung, mittlerweile sollten die Sommersporen (Uredosporen, Generation II) aktiv sein, und vor zwei Wochen (24.6.) habe ich neue Proben genommen und im REM angeschaut.
Da ich nach wie vor nirgends aussagekräftige Bilder zu den diversen Sporengenerationen dieses eigentlich sehr häufigen Pilzes gefunden habe, bin ich mir bezüglich Bestimmung der Sporen nicht sicher. Die in Abb. 13 und 14 gezeigten Sporen sind bei Betrachtung mit freiem Auge etwas bräunlicher als die knallgelben Aecidiosporen in Abb. 4 bis 8. Im REM sehen die Sporen sehr ähnlich aus. Der Warzenhof der Aecidiosporen (Abb. 8 ) ist ausgeprägter als jener der Uredosporen (Abb. 13). Die Uredosporen scheinen auch eher auf dem Blatt zu wachsen (Abb. 14) , während die Aecidiosporen (Abb. 6) aus dem Blattinneren hervorquellen. Falls ich mit der Bestimmung daneben liege, bitte um Korrektur.
Aufnahmetechnisch arbeite ich mittlerweile mit deutlich geringeren Säulenspannungen als am Anfang der Brombeerrost-Odyssee: Mit 5kV kommen die Oberflächendetails der Sporen deutlich besser zum Vorschein als mit 10 oder 15kV.
Liebes Forum,
mittlerweile bin ich etwas weitergekommen mit der Mikroskopie am Brombeerrost. Es ist gar nicht so leicht, alle 5 Sporengenerationen dieses Rostpilzes unters Mikroskop zu bekommen. Wen das Thema interessiert, auf der Homepage der MGW gibt es einen Artikel dazu
Vom Brombeerrost, der im Garten sprosst. (https://www.mgw.or.at/brombeerrost/)
Unten noch ein paar Aufnahmen der Sporen 0 bis IV. In den vorigen Posts in diesem Thread habe ich ursprünglich ein paar Sporen falsch identifiziert, das habe ich ausgebessert.
LG
Jürgen
2024-04-22 16-34-43 (C,S2)-Bearbeitet-2.jpg
25-001-pr03-brombeere-02-Bearbeitet-Bearbeitet.jpg
uredien_3-Bearbeitet.jpg
P1004050-Bearbeitet.jpg
brombeer_rost6-Edit.jpg
Hallo Jürgen,
ich kannte den bisherigen Bericht nicht. Ein tolles Projekt, bei dem Du mega viel Einsatz und Durchhaltevermögen zeigen musstest. Die Bilder sind natürlich toll und bestaunenswert.
Wieder mal ein Beispiel für die unglaubliche Vielfalt des Lebens und die Ästhetik des oft Übersehenen.
Hallo Peter,
danke für das Lob, freut mich. So wie das Leben im Wassertropfen immer wieder spannende Einblicke in den Mikrokosmos bietet, ist das Reich der Pilze immer für Überraschungen gut.
Der Vorteil für mich: Es bewegt sich nichts und davonlaufen können diese Dinger auch nicht. Das macht das Mikroskopieren etwas entspannter. Der Preis dafür ist, dass man manchmal ein Jahr warten muss, bis es wieder weitergeht. Sozusagen das ultimative Entschleunigungsprogramm
Jürgen
Hallo Jürgen,
Eine ausgesprochen schöne Darstellung mit wunderbaren Aufnahmen. Am Brombeerrost habe ich mich auch lange versucht und daran die Pianese-Färbung versucht zu optimieren. Meiner Erfahrung nach liefert die Pianese-Färbung nur gute Kontraste wenn die umliegenden Zellen im Rahmen der Abwehrreaktion verholzen. Die Pilzhyphen färben sich stets schön rosa, das gesunde Gewebe bleibt meist farblos außer es hat bereits eine defensive Lignifizierung eingesetzt.
Als Alternative könnte man mal eine Astrablau-Säurefuchsin Färbung versuchen da Astrablau unverholzte Zellwände färbt. Malachitgrün besitzt durch seine enge chemische Verwandschaft zum Fuchsin dieselben Färbeeigenschaften.
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=41942.msg309409#msg309409 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=41942.msg309409#msg309409)
Vergleiche z.B. am Versuch der Hundsrose mit Sternrußtau Befall. In der FCA-Färbung färben sich durch Fuchsin sowohl die Pilhyphen, als auch das lignifizierte Gewebe um den Pilzbefall herum rot. In der Pianese-Färbung hingegen erhält man einen schönen Kontrast, da das Säurefuchsin die lignifizierten Komponenten nicht anfärbt und diese durch Malachitgrün gefärbt werden. Die gesunden Zellwände bleiben in der Pianese-Färbung defacto ungefärbt.
Zusammenfassend wird man je nachdem wo man einen Pilzbefall nachweisen möchte auf unterschiedliche Färbungen zurückgreifen müssen. Ist das Blatt bereits makroskopisch von braunen und damit lignifizierten Stellen durchsetzt ist die Pianese-Färbung eine gute Wahl.
Möglicherweise lässt sich auch die PAS-Reaktion anwenden. Diesbezüglich habe ich bereits mehrere Anläufe unternommen und bei einem Ahornblatt mit Rhythysma acerinum Infektion in Kombination mit eine Astrablau Färbung exzellente Resultate Erhalten (Säurefuchsin färbt nämlich leider auch Chloroplasten rot an, im der PAS Reaktion bleiben sie ungefärbt). Interessanterweise war der Brombeerrost in der PAS Reaktion negativ. Daskann Ich mir aktuell noch nicht gänzlich erklären, entweder ich habe falsch gearbeitet, oder die Zellwand des Brombeerrost ist chemisch PAS negativ.
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=47939.msg352852#msg352852 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=47939.msg352852#msg352852)
Hallo Alf,
danke für Deine Hinweise auf Deine Färbeversuche mit den verpilzten Pflanzenschnitten. Ich muss gestehen, ich hatte das schon wieder vergessen, obwohl ich mir den Thread damals sehr gerne angeschaut habe.
Mit der Pianese-Färbung war ich auch nie wirklich ganz glücklich. Der Vorteil ist halt, dass man sie kommerziell erhält, und manchmal ergeben sich auch schöne und aussagekräftige Bilder. Den Brombeerrost hake ich jetzt einmal ab, aber für das nächste Pilz-Projekt (Orchideenmykorrhiza) werde ich das Färbethema wideer aufleben lassen (müssen).
Pianese ist da eine Option, aber auch Lactophenol-Baumwollblau und/oder Uvitex. Die Proben (Wurzel des roten Waldvögleins und Mykorrhiza an Buchenwurzeln) schwimmen schon in Ethanol. Schneiden ist ein Thema (Technovit oder Paraffin?) und dann Färben. Das klingt schon wieder nach einer Sache, die recht aufwändig werden kann.
Dein Ansatz über PAS klingt sehr spannend, aber das übersteigt meine Fähigkeiten mit Herstellung und Anwendung der Färbungen etwas, fürchte ich.
LG
Jürgen
Hier kommt noch ein Nachschlag zum Brombeerrost. Da ich gerade mit Pilzfärbungen und Paraffinschnitten arbeite, habe ich noch eine 6 Monate alte Probe (Brombeerblatt aus der zweiten Maihälfte 2024) angeschaut. Das Blatt wurde war ca. 24h in AFE, dann 6-7 Monate in 70%EtOH, dann über 100% EtOH, Methylbenzoat, Xylol, 50:50 Xylol/Paraffin und 100% Paraffin eingebettet. Geschnitten wurde am Rotationsmikrotom 7-8µm dick.
Gefärbt habe ich diesmal mit Baumwollblau/Milchsäure, siehe Bilder unten. Das wird zwar nicht so "bunt" wie die Pianese-Färbung. Allerdings sind mir die Färbungen mit Pianese zu wenig konsistent und die Differenzierung ist für meinen Geschmack zu zufällig wenn man das Ausmaß der Lignifizierung der verpilzten Stelle nicht kennt (siehe Anmerkung von alf weiter oben).
Deshalb diesmal in monotomen Jeans-Blau, gefällt mir durchaus. Man sieht in der ersten Abbildung (20x HC PL Fluotar Objektiv) die Gesamtsituation mit dem Sporangium an der Blattoberseite und dem Aecidium an der Blattunterseite. In den markierten roten Rechtecken sind Schraubengefäße, die sich leicht gegen den Hintergrund abzeichnen. Im Rechteck (a) sind in meinen Augen die Pilzhyphen erkennbar.
Bei 40x-Vergrößerung (Abb. 2) wird offensichtlich, wie sich Pilzhyphen entlang solcher Gefäße voranarbeiten, um die Verbindung zwischen Blattober- und Unterseite herzustellen. Bei der Aufnahme mit dem 100x-Objektiv werden die einzelnen Aeciosporen erkennbar, die noch von einer Zellschicht an der Blattunterseite bedeckt sind.
LG
Jürgen
abb_1_20x.jpg
Abb.1: Aufnahme mit dem 20x-Objektiv (Stack aus 5 Bildern)
abb_2_40x.jpg
Abb.2: Crop aus einer Aufnahme mit dem 40x-Objektiv.
abb_3_100x.jpg
Abb.3: Stack aus 5 Aufnahmen mit dem 100x-Objektiv (immergiert).