Mikro-Forum

Hallo zusammen,

Ich hatte heute in der Uni die Chance bei der Besamung und Befruchtung der Eizellen eines Platynereis dumerilii Weibchens zugegen zu sein, und diese dann über einige Stunden zu beobachten. Blöderweise habe ich nur mein Handy als Fotogerät dabei gehabt, und leider habe ich auch nur 2 Fotos gemacht. Trotzdem möchte ich diese dem Interessierten nicht vorenthalten.

Platynereis dumerilii ist ein Salzwasser Borstenwurm, der als Modellorganismus in vielen Labors gehalten wird. Die Eizellen reifen in der Leibeshöhle heran und werden nach einem interessanten Paarungsspiel ausserhalb des Körpers befruchtet.

An der Spermienspitze sitzt das Acrosom, das bei Kontakt mit der Eizelle Enzyme freisetzt die unter anderem die Gallerthülle und die Vitellinmembran der Eizelle verdauen. Unter dem Acrosom sitzen Bindin-Elemente die Artspezifisch die Verschmelzung des Spermiums mit der Eizelle einleiten. Das Spermium übergibt seinen Zellkern und sein Centrosom in das Cytosol der Eizelle.

Unmittelbar nach dem Acrosomkontakt kommt es zu einer Aktivierung der Eizelle. Um das Eindringen mehrerer Spermien zu verhindern (Poly-Spermie) werden Ca²+ Kanäle geöffnet, und durch das Eindringen der Kationen wird das Membranpotential von etwa -70mV auf etwa +20mV gesteigert. Die Gallerthülle die die Eizelle umgibt schwillt (Ooplasmatische Segregation) an und drückt somit alle andere Spermien ausser Reichweite.

Nach dieser Besamung folgt die Befruchtung, in der die Zellkerne verschmelzen und somit das Erbmaterial des Vaters und der Mutter zusammenwachsen.

Es folgt die Furchung, eine Zellteilung ohne Volumenänderung. Die Zelle teilt sich inäqual, zwei ungleichgroße Tochterzellen enstehen und man spricht vom 2 Zell Stadium. Diese beiden Zellen teilen sich wiederrum, so das 4 Zellen entstehen. Diese Zellteilungen gehen sehr schnell von statten, man kann quasi zuschauen. Das ist möglich da die Eizelle auf von der Mutter angelegte Speicher aus RNA, Proteinen und Nährstoffen zurückgreifen kann, deren Synthese sonst länger dauern würde. Durch weitere Zellteilungen ensteht aus der Eizelle die Morula, ein kugeliger Zellhaufen, aus der dann die Blastula (flüssigkeitsgefüllte Kugel) und dann die Gastrula (Einstülpung und Entwicklung der Keimblätter) entsteht.

Mir sind wie oben schon gesagt 2 Bilder mit ca. 3 Minuten Abstand gelungen, die etwa 2 Stunden nach dem Begattungsritual geschossen wurden. Wir befinden uns zwischen 8 und 16 Zell-Stadium, man kann in der unscharfen Ebene die Urzellen (1A-D) erkennen, in scharfen Ebene deren Tochterzellen (1a-d). Im zweiten Bild erkennt man undeutlich die neuen Furchen des 16-Zell-Stadiums.
Die ganze Beobachtung war sehr spannend, so daß ich Fotos schiessen und alles um mich herum leider vergessen habe.

Besten Gruß,
Jan

Hallo Jan,

sehr interessant beschrieben und  unter den Umständen gut gelungene Aufnahmen.

Es müssen nicht immer die perfekten Aufnahmen sein (die liebe ich natürlich sehr)
aber so eine Dokumentation zeigt das Leben pur und das wartet nicht.

Vielen Dank und Grüße

Herbert

Hallo,

ich betätige mich hier mal als Grabschänder, und hole diesen alten Beitrag aus der Versenkung.

Ich konnte heute etwa 24 Stunden alte Platynereis dumerilii Larven aus der Uni mitnehmen. Ich hatte ja oben schon versucht die Entwicklung nach 2 Stunden darzustellen, nun kann ich vielleicht ein bisschen mehr demonstrieren. Hier zuhause habe ich leider immer noch nur sehr begrenzte Möglichkeiten (hier dargestellt https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=8653.0). Bilder aufnehmen kann ich momentan auch nur mit meiner Handykamera, da ich für meine Spiegelreflex nur ein Zoomobjektiv da habe. Wie dem auch sei, ich hoffe das ich ein paar Entwicklungsstadien beobachten, und vielleicht auch festhalten kann.

Den Anfang macht jetzt einfach die sogenannte Trochophora-Larve (http://de.wikipedia.org/wiki/Trochophora) etwa 24 Stunden nach Befruchtung. Aufgenommen in 400x Vergrößerung. Die apikale Seite ragt aus dem Monitor raus.


Die großen, runden Strukturen (lp) sind Lipidtropfen, von denen sich die Larve die erste Zeit ernährt. Als mm sind die Makromeren bezeichnet, die ihre Ursprünge aus dem 8 Zell Stadium haben (siehe erster Beitrag). Ansonsten sieht man noch die Pigmentierung der zwei larvalen "Augen" (le), und den Cilien-Kranz für die Fortbewegung (ck).


Eine Grafik zur besseren Illustration. (Fischer et al. Frontiers in Zoology 2010 7:31   doi:10.1186/1742-9994-7-31)


Ich bin sehr gespannt, wie lange die kleinen Larven in einem Eppi mit Meerwasser überleben, hoffe jedoch das ich noch ein paar Entwicklungsschritte aufzeigen und beobachten kann.

Schöne Grüße,
Jan

Tja, des war wohl nichts. Meine kleinen Larven sind leider viel zu früh eingegangen... in einem Eppi lebt es sich anscheinend nicht so gut.

Jedoch möchte ich gerne noch 2 Fluoreszens-Impressionen zeigen. Behandelt mit dem Kernfarbstoff Hoechst 33342 (http://en.wikipedia.org/wiki/Hoechst_stain)und unter UV angeregt, einmal eine 48 Stunden alte Larve, einmal 72 Stunden. Bei Intresse zeige ich gerne noch mehr, habe noch Fotos von den jeweiligen Stadien, die jedoch mit einem Primärantikörper gegen Serotonin behandelt wurden, um die ersten Nervenzellen anzuzeigen die Serotonin herstellen.

48 Stunden

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/86373_49353191.jpg)


72 Stunden

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/86373_10214923.jpg)

Hallo,

na so richtig auf Interesse stoße ich anscheinend nicht. ;)

Trotzdem wie angedroht die Fotos der Immunhistochemie gegen Serotonin.


Immunhistochemie ist eine Standartmethode um spezifische Strukturen in Geweben darzustellen. Man macht sich hier die spezifische Erkennungsstelle von Antikörpern zunutze. Antikörper sind Teile des Immunsystems von Wirbeltieren, die in ihrer natürlichen Funktion körperfremde Strukturen erkennen können, und diese markieren, damit weitere Maßnahmen eingeleitet werden können. Bei der Immunhistochemie werden spezielle Antikörper gewonnen, indem man beispielsweise Mäusen die Struktur spritzt, den man später mal markieren möchte. Das Immunsystem der Mäuse bildet dann gegen diesen körperfremden Stoff Antikörper.

Nach einer Weile entnimmt man der Maus Blutplasma und hat in diesem den speziellen Antikörper, mit allen anderen Antikörpern die die Maus sonst noch so hat. In aufwendigen Reinigungsschritten kann dann der Antikörper isoliert werden, der gegen die gewünschte Struktur bindet. Man nennt diese dann polyklonale Antikörper, da sie von vielen verschiedenen Zellen gebildet wurden.

Spezifischer wird das ganze wenn man der Maus die Milz entnimmt, die Milzzellen (Ursprung der Antikörper) vereinzelt und zu unsterblichen (Krebs-)Zelllinien transformiert. In einem extrem aufwendigen Verfahren muss dann unter den abertausenden die Zelllinie selektiert werden, die genau den Antikörper bildet den man möchte. Man nennt diese dann monoklonale Antikörper, da sie genau einer Urprungszelle entspringt. Der Vorteil hier ist, das man nach Analyse des Antikörpers haargenau herausfindet, gegen welche Moleküle dieser bindet, und man einen quasi unerschöpflichen Vorrat aus der unsterblichen Zelllinie erhält.

Nun hat man also die Möglichkeit eine bestimmte Struktur mit diesem Antikörper zu "markieren". Das ganze bringt erstmal nicht viel, da man die AKs nicht unter dem Mikroskop sehen kann. Nun hat aber ein genialer Geist intelligent kombiniert. Hat man diesen Primärantikörper aus der Maus gewonnen, kann man doch einen weiteren, sekundären, Antikörper gegen Mäuse aus einem anderen Organismus bilden lassen. Dieser muss nicht monoklonal sein, da er ja nur generell gegen "Maus" markieren muss, und ist somit günstiger zu produzieren.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/86780_42693904.jpg)
Quelle: http://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Immunohistochemistry.jpg
http://de.wikipedia.org/wiki/Immunhistochemie

Jetzt kommt der Clou, diesen sekundären AK konjugiert man chemisch mit beispielsweise einem Farbstoff der sich mit Licht anregen lässt. Der Primärantikörper Maus markiert also beispielsweise das Molekül Serotonin, der sekundäre AK markiert Maus und leuchtet unter dem Fluoreszens Mikroskop auf. Somit kann man in einem Gewebe also genau die Orte nachweisen in denen Serotonin vorhanden ist.

Man kann natürlich den sek. AK noch anderweitig behandeln, gängig ist auch eine Kopplung mit einem Enzym, das ein Substrat unter Farbstoffbildung umsetzt. Somit erhält man sogar Dauerpräparate.


So, viel einleitender Text, nun 2 Bilder bei denen diese Methode angewandt wurde. Der primäre AK markiert den Neurotransmitter Serotonin, der sekundäre ist mit einem grün fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/86780_5619610.jpg)

Das erste Bild zeigt eine Larve des altbekannten Anneliden Platynereis dumerilii, 48 Stunden nach Befruchtung der Eizelle. Man kann deutlich die erste Nervenzelle der Larve erkennen, die Serotonin produziert. Die dünnen "Fäden" sind die Nervenbahnen. Die restlichen kleinen Punkte sind Orte an denen der AK unspezifisch gebunden hat. Die Larve zeigt ein schwach grünes Hintergrundleuchten.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/86780_29077455.jpg)

Nach 72 Stunden ist in einer Larve deutlich mehr zu erkennen. Man erkennt mindestens 4 Zellkörper im "Kopfbereich", und ein deutlich verzweigteres Nervensystem. Auch im "Bauch" haben sich neue Nervenzellen gebildet, oder alte haben Serotonin produziert.


Nächste Woche werde ich vielleicht noch ein paar Bilder und Erklärungen zu einer weiteren Methode, der "In-Situ-Hybridisierung" zeigen können.

Schönen Abend,
Jan

Hallo Jan

Sei Dir zumindest meines VOLLEN Interesses bewusst. Allein in bin ob der Qualität und Proffesionalität deines Beitrags bisher "ehrfürchtig verstummt".
geht wahrscheinlich auch anderen so....

Aber VIELEN DANK für den super Beitrag

Martin

Hallo Jan,

na, das Interesse an Deinen Beiträgen ist doch recht ordentlich, über tausend Aufrufe.

Die geringe Zahl an Antworten mag mit der Komplexität des Themas und damit zusammenhängen, daß monoklonale Antikörper (noch) nicht zur Standard-Ausrüstung eines Hobby-Mikroskopikers gehören.

Viele Grüße

Rainer

Danke für die aufmunternden Worte. :)

Standart-Ausrüstung... tja, meine Heimausrüstung ist sehr, sehr dürftig. Ein HM-Lux ohne Köhlersche Beleuchtung, ohne jeglichen Schnickschnack. Ich habe das Glück während dem Studium doch einiges geboten zu bekommen, und versuche das hier ein bisschen darzustellen und meine grenzenlose Faszination rüberzubringen.

Die Welt durchs Mikroskop ist einfach zauberhaft. Ich kann mich gut an die 5. Klasse erinnern, der erste Blick durch ein uraltes Schulmikroskop mit Spiegelbeleuchtung. Als ich dann jedoch die ersten Tierchen im Wassertropfen rumschwirren sah, hatten sie mich. :)

In-situ-Hybridisierung von mRNA

Hallo,

wie versprochen heute eine kurze Einführung und Darstellung der In-situ-Hybridisierung.


Unser Genom besteht ja bekanntlich aus DNA. Das zentrale Dogma der Biochemie lautet, das aus DNA sogenannte mRNA gebildet wird,
nach deren Anleitung dann ein Protein zusammengebaut wird. Die DNA ist also mit einem Bauplan vergleichbar, aus dem ein Stück als
"Arbeitskopie" herausgeschrieben wird, nach deren Anleitung dann ein Protein erstellt wird.


(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/87065_43041955.jpg)
Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/50/Molbio-Header.svg/500px-Molbio-Header.svg.png

Was sind Proteine? Zitat aus Wikipedia:
Proteine oder Eiweiße (seltener: Eiweißstoffe) sind aus Aminosäuren aufgebaute biologische Makromoleküle. Proteine finden sich in allen
Zellen und verleihen ihnen nicht nur Struktur, sondern sind auch ,,molekulare Maschinen", die Metabolite transportieren, Ionen pumpen,
chemische Reaktionen katalysieren und Signalstoffe erkennen.

Da Zellen sehr unterschiedliche Funktionen haben, müssen Zellen auch unterschiedliche Proteinzusammensetzungen aufweisen. Auch zeitlich
ist diese Zusammensetzung unterschiedlich.

Wie kann man nun Nachweisen welche Proteine in der Zelle zu einem Zeitpunkt vorhanden sind? Dazu hatten wir oben schon die Immunohistochemie
kennengelernt.

Wie kann man jedoch Nachweisen welche mRNA, also welche "Arbeitskopien" in einer Zelle vorhanden sind? Dies geht beispielsweise mit
der In-situ-Hybridisierung von mRNA.

Die mRNA liegt in der Zelle im Gegensatz zur DNA als Einzelstrang vor und kann dadurch mit komplementärer einzelsträngiger DNA einen
Doppelstrang bilden.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/87065_19889731.jpg)
Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/fd/Difference_DNA_RNA-DE.svg/600px-Difference_DNA_RNA-DE.svg.png

Will man also ein bestimmtes Protein, und damit Gen, nachweisen, stellt man sogenannte cDNA (komplementäre DNA) her, die genau
den gegensätzlichen Code von dem Protein bzw. Gen hat, das man sichtbar machen möchte.

Der Trick hier ist das man an diese cDNA noch etwas anhängt. Entweder einen fluoreszierenden Farbstoff, oder wie gleich bei den Bildern
ein Enzym das ein Substrat unter Farbstoffbildung umsetzt. Ein Enzym ist vereinfacht gesagt, ein Protein das eine chemische Reaktion
ablaufen lässt, zum Beispiel haben Laktoseintolerante Menschen funktionsunfähige oder zukleine Mengen des Enzyms Laktase, das Laktose spaltet.

Der Ablauf ist das wie folgt:

Man gibt zu einem vorher fixierten Gewebe die cDNA des gewünschten Gens hinzu und lässt dieser Zeit sich mit der jeweiligen mRNA zu treffen.
Dann wäscht man die restliche cDNA die nicht gebunden ist aus dem Gewebe heraus.
Man gibt eine Chemikalie hinzu die durch die chemische Reaktion des Enzyms einen Farbstoff entstehen lässt.
Man kann nun das Gewebe mikroskopieren und Aussagen treffen wo das Gen aktiv war.

Zu den beiden Bildern:

Es wurde eine In-situ-Hybridisierung eines sogenannten Hox-Gens vorgenommen. Hox-Gene sind in der Entwicklung von Lebewesen wichtig. Schauen wir
uns unseren alten bekannten, den Wurm Platynereis dumerilii an, so wird aus einer einzigen Zelle ein Wurm mit vielen Segmenten. Hox-Gene sind
vereinfacht gesagt für die Identität eines Segments zuständig. Die Zellen in einem Segment müssen eine gewisse Orientierung haben, und außerdem
wissen was sie mal werden sollen. Ein Beinchen, bei Insekten vielleicht ein Mundwerkzeug oder ein Flügel und so weiter. Die unterschiedliche Aktivierung
von Genen sorgt für ein unterschiedliches Schicksal einer Zelle.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/87065_10172618.jpg)

Das Erste Bild zeigt einer 57 Stunden alte Larve, in der Bereits die ersten 3 Segmente sichtbar sind (kleine Bürsten oder Haare im innern).
Man sieht gut das das gewählte Gen im ersten Segment (Mitte der Larve) nicht aktiv ist. Die beiden unteren Segmente sind schwarz gefärbt,
das heist das hier die cDNA gebunden war und Farbe umgesetzt hat. Orientierung im Bild: Oben Anterior, Unten Posterior, aus dem Bildschirm heraus vermutlich ventral.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/87065_14424170.jpg)

Das zweite Bild zeigt ebenfalls eine 57 Stunden alte Larve, mit anderer Orientierung. Oben dorsal, ins Bild hinein posterior. Man schaut also von hinten auf das Hinterende
der Larve. Man sieht hier das das Gen im ventralen Bereich stärker aktiv war, und dorsal sogar eine freie Stelle ist.


Viele Grüße,
Jan

Hallöchen,

ich melde mich mal wieder zu Wort. Weiter gehts in der Erforschung der Entwicklung von Platynereis.

Zwei neue Fotos möchte ich in meinem Monolog zum besten geben, es geht um die frühe Muskelentwicklung in der Larve.

Genutzt wurde wiedermal die Immunohistochemie, wie oben schon erläutert. Diesmal wird Phalloidin genutzt, ein Gift des Knollenblätterpilzes das, kurz gesagt, an Muskel Strukturen bindet. Dieses Phalloidin wurde mit einem grün leuchtenden Fluoreszens Farbstoff konjugiert, so das man es unter dem Mikroskop zum leuchten bringen kann.

Zuerst ein Foto einer 34 Stunden alter Larve:

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/90728_23397093.jpg)

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/90728_19756746.jpg)
Legende: a = anterior, p = posterior, lp = lipidtropfen, *dlm = dorsale Längsmuskulatur

Man sieht noch nicht viel, es bilden sich die ersten Fasern der dorsalen Längsmuskulatur.

Nach 58 Stunden wird das ganze schon intressanter:

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/90728_4720237.jpg)

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/90728_59312024.jpg)
Legende: st = Mundfeld, vlm = ventrale Längsmuskulatur, vqm = ventrale Quermuskulatur, mvlm = medial ventral longitudinal muscle

Innerhalb 24 Stunden bildet sich quasi die komplette Muskulatur des larvalen Jungwurms. Die dorsale Längsmuskulatur liegt im 2. Bild in einer anderen Schärfeebene.

Für sich alleine genommen keine besonders spektakulären Fotos, jedoch ist dies auch nur die Kontrollgruppe zu einem Versuch, der Auswirkungen der Inhibition des Delta-Notch-Signaltransduktionsweges während der Entwicklung aufzeigen soll. Bei Intresse zeige ich auch gerne mehr Fotos. Unter anderem wäre noch Färbung des kompletten Nervensystems, bzw. der Axone, sowie eines Neurotransmitters vorhanden.

Schöne Grüße,
Jan

Hallo Jan,
auch ich kann hier nicht mitreden, nur lesen; das aber gerne.
Es erweitert den Horizont und macht neugierig.
Nur weiter so!
gruß
Wolfgang

Hallo Jan -

kann man die Muskelfasern auch ohne histochemische Färbung erkennen?

Gruß

Rolf

Hallo Wolfgang, vielen Dank.

Hallo Rolf,

ich kann es ehrlich gesagt nicht.

Im Durchlicht oder hier im Interferenzkontrast sieht man die Borsten sehr gut. Selbige setzen an der Muskulatur in den Borstentaschen an, aber für mich ist da leider nichts ersichtlich. Die gelben Strukturen sind übrigens Spinndrüsen. Das Mundfeld ist ebenfalls zu erkennen.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/90738_61119309.jpg)

Lieben Gruß,
Jan

...diese Fotos sind aber nicht mit der Handykamera gemacht, oder?

Meine Diplomarbeit war auch entwicklungsbiologisch und auch mit Fluoreszenz. Platynereis war in meiner AG auch zuhause, ich hatte allerdings Hydractinia echinata vor der Linse, Platynereis hatten die Anderen. Vielleicht scanne ich da auch mal ein paar alte Bilder ein - aber nicht jetzt, sorry (digital war da noch nicht, ist alles auf Film). Will Dich dennoch ermuntern, weiterzumachen. Falls Du da ein paar Arbeiten aus der AG genannt bekommen willst, schaue ich gerne mal nach (die Leute haben zur Entwicklung teilweise sehr gute Fotos gemacht), vielleicht kennst Du sie aber schon oder bist schon "moderner" (mit cDNA wurde bei uns noch nicht gearbeitet).

Für Hox gibt es wohl noch keine Antikörper? Ich stelle mir vor, daß das Bild dann noch genauer wäre, als mit dem Enzym/Substrat.

Zitat von: RainerTeubner in Februar 28, 2012, 20:00:22 NACHMITTAGS
Die geringe Zahl an Antworten mag mit der Komplexität des Themas und damit zusammenhängen, daß monoklonale Antikörper (noch) nicht zur Standard-Ausrüstung eines Hobby-Mikroskopikers gehören.

Fluoreszenzfarbstoffe gibt es immerhin einige, die recht einfach anzuwenden sind - bloß wieder das Problem für den Hobbymikroskopiker: das entprechende Mikroskop dazu...

Hallo Jan -

schon mal mit gekreuzten Polfiltern probiert? Muskelfasern könnten da vielleicht sichtbar werden.

Gruß

Rolf

Hallihallo,

Zitat von: Oecoprotonucli in April 19, 2012, 20:16:13 NACHMITTAGS
Für Hox gibt es wohl noch keine Antikörper? Ich stelle mir vor, daß das Bild dann noch genauer wäre, als mit dem Enzym/Substrat.

Das Enzym sitzt ja am Antikörper gegen Hox. Der Vorteil der Enzymumsetzung ist ein Dauerpräparat, da kein Fluoreszensfarbstoff ausbleichen kann.

Zitat von: reblaus in April 19, 2012, 23:50:24 NACHMITTAGS
schon mal mit gekreuzten Polfiltern probiert? Muskelfasern könnten da vielleicht sichtbar werden.

Bisher nicht, glaube im Institut wird mit Polfiltern nicht gearbeitet. Wir Studenten dürfen immerhin die Fluoreszensmikroskope benutzen, aber die richtigen Profis dort arbeiten fast nur am Konfokalen Laser Mikroskop, aber da werden wir noch nicht rangelassen. Ich glaube mit Polfiltern kennt sich dort auch niemand aus, werde aber mal nachfragen. Das Problem ist denke ich, das da wirklich nur bestimmte Strukturen verglichen werden, die man dann auch ausschliesslich sehen möchte, daher stört alles andere im Bild.

Nochmal ein paar Impressionen von heute:

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/90814_25105139.jpg)

Primär-Antikörper gegen acetyliertes Tubulin, was unter anderem in Axonen von Neuronen vorkommt. Die richtig leuchtenden Stellen sind der Wimpernkranz, ganz zart im inneren sind die ersten 2 Nervenbahnen des Bauchmarks zu erkennen, oben im "Kopf"-Bereich sieht man Neuronen und Nervenbahnen des werdenen Gehirns.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/90814_22677740.jpg)
Dasselbe in einer Sicht von apikal.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/90814_57372146.jpg)
Hier ein wie ich finde sehr schönes Untertassen Foto.
Eigentlich sollten hier ein Neurotransmitter angefärbt sein, der aber noch nicht zu sehen ist in diesem Entwicklungsstadium. Sehr schön aber die Autofluoreszens der Wimpernkränze und von Drüsen im Kopfbereich.

Schöne Grüße,
Jan

Diese Aufnahmen sind ja nun mal der Hammer! "Protuberanzen einer dunklen Sonne" - selbst falls man nicht wüßte, was das ist, wären diese Bilder sehr anregend!

Zitat von: 7an in April 20, 2012, 13:44:55 NACHMITTAGS

Zitat von: Oecoprotonucli in April 19, 2012, 20:16:13 NACHMITTAGS
Für Hox gibt es wohl noch keine Antikörper? Ich stelle mir vor, daß das Bild dann noch genauer wäre, als mit dem Enzym/Substrat.

Das Enzym sitzt ja am Antikörper gegen Hox. Der Vorteil der Enzymumsetzung ist ein Dauerpräparat, da kein Fluoreszensfarbstoff ausbleichen kann.

Ach ja, da habe ich wieder einmal schneller geschrieben als gedacht :-[ ich meinte wohl: Fluoreszenzgekoppelten Antikörper.
Denn ich glaube und wollte sagen, dass der Nachteil eben ist, dass leicht zu viel Substrat vor Ort gebildet wird, so dass sich die Färbung leicht zu breit macht und zu stark wird und Anderes überdeckt, wenn man nicht aufpasst. Mit einem Fluorophor pro Antikörper wäre das Bild - glaube ich - wahrscheinlich etwas schärfer (aber wie Du sagst, dann wohl leider auch schneller weg, also ausgeblichen...)

Zitat von: 7an in April 20, 2012, 13:44:55 NACHMITTAGS
Primär-Antikörper gegen acetyliertes Tubulin, was unter anderem in Axonen von Neuronen vorkommt. Die richtig leuchtenden Stellen sind der Wimpernkranz, ganz zart im inneren sind die ersten 2 Nervenbahnen des Bauchmarks zu erkennen, oben im "Kopf"-Bereich sieht man Neuronen und Nervenbahnen des werdenen Gehirns.

...Du setzt also voraus, dass wir wissen, dass eben die Wimpern eine große Menge und hauptsächlich Mikrotubuli enthalten (Stichworte: "Axonem", "9+2-Muster")...

Hallo mal wieder.

Zitat
Ach ja, da habe ich wieder einmal schneller geschrieben als gedacht :-[ ich meinte wohl: Fluoreszenzgekoppelten Antikörper.
Denn ich glaube und wollte sagen, dass der Nachteil eben ist, dass leicht zu viel Substrat vor Ort gebildet wird, so dass sich die Färbung leicht zu breit macht und zu stark wird und Anderes überdeckt, wenn man nicht aufpasst. Mit einem Fluorophor pro Antikörper wäre das Bild - glaube ich - wahrscheinlich etwas schärfer (aber wie Du sagst, dann wohl leider auch schneller weg, also ausgeblichen...)

Vielleicht spielt es auch eine Rolle das die Enzymfärbung günstiger ist. Wenn man sich mit unseren Dozenten unterhält kann man sich nur die Haare raufen was da noch für Mittel pro Kopf übrigbleiben. Trotzdem bin ich froh das wir doch motivierte Lehrende haben die uns einiges bieten.

Zitat...Du setzt also voraus, dass wir wissen, dass eben die Wimpern eine große Menge und hauptsächlich Mikrotubuli enthalten (Stichworte: "Axonem", "9+2-Muster")...

Mein Fehler, ich werde mich in Zukunft bemühen mehr Erläuterungen zu geben.

Mal weiter im Thema:

Für unser Versuchsprotokoll müssen wir nun also die Auswirkungen darstellen, die das künstliche Ausschalten des Signaltransduktionsweges Notch+Delta auf die Frühentwicklung von Platynereis dumerilii hat. Eine Signaltransduktion ist eine Möglichkeit der Zell-Kommunikation. Im Falle von Notch und Delta ist Delta das signalgebende Protein und Notch das signalempfangende, also der Rezeptor. Da Delta ein Protein ist das fest in der Zellmembran verankert ist gehört diese Art der Kommunikation zu den sogenannten juxtakrinen Kommunikationswegen. Es gibt natürlich auch lösliche Faktoren die dann zu para- oder endokrinen Kommunikationswegen zugeordnet werden. (Wikipedia Links: Signaltransduktion (http://de.wikipedia.org/wiki/Signaltransduktion), Notch-Signalweg (http://de.wikipedia.org/wiki/Notch-Signalweg),

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/91431_34575462.jpg)
Quelle: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Notchccr.gif

Notch und Delta sind in vielen Organsimen wichtig in der Differenzierung bestimmter Strukturen in der Entwicklung. Bei Drosophila spielt es beispielsweise in der Bildung des Nervensystems eine Rolle. Bei Arthropoden ist eine Mitwirkung an Segmentierungsprozessen beschrieben. Bei Platynereis dumerilii soll dieser Signalweg nun ausgeschaltet werden und die Auswirkungen auf die Morphologie, das Nervensystem, die Muskulatur und einen bestimmten Neurotransmitter untersucht werden. Zum ausschalten des Signalweges gibt es mehrere Möglichkeiten. Nach dem "andocken" von Delta an Notch erfährt das Protein eine Konformationsänderung, das heißt es ändert seine dreidimensionale Form. Dadurch wird ein anderes Protein aktiviert, eine sogenannte Protease, deren Aufgabe es ist Proteine an bestimmten Stellen zu schneiden (im Bild Proteolysis). Das abgeschnittene Stück NICD (Notch intracellular domain) wandert dann in den Zellkern und nimmt Einfluss auf die Aktivität bestimmter Gene. Bei uns wurde die Kaskade aufgehalten, indem die Protease inhibiert wurde.

Hier nun die direkte Gegenüberstellung der Bilder in denen Delta+Notch aktiv und inaktiv ist. Fangen wir an mit der Markierung der Muskulatur durch Phalloidin.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/91431_34601429.jpg)

Links die unbehandelten Larven, rechts die bei denen Delta+Notch ausgeschaltet ist.
Die Bilder A+B sind von 34 Stunden alten Larven in anterior-posteriorer Ansicht, man schaut quasi auf den Popo. Die großen "Löcher" sind Lipidtropfen, von denen die Larve sich anfangs ernährt. Mit dlm ist die dorsale (rückwärtige) Längsmuskulatur gekennzeichnet, man sieht gut die einzelnen Muskelfasern. Im Prinzip sind keine Unterschiede zu erkennen.

Die Bilder C+D zeigen 58 Stunden alte Larven, ebenfalls in dorsoventraler Ansicht wobei die Schärfeebene im ventralen Bereich liegt. Durch vlm wird die ventrale Längsmuskulatur gekennzeichnet, mvlm der medial ventrale Längsmuskel, om sind Schrägmuskeln und ppm die Parapodialmuskeln. Auffallend ist das Fehlen von ppm und mvlm im Bild D.

Die Bilder E+F zeigen 58 Stunden alte Larven, ebenfalls in dorsoventraler Ansicht wobei die Schärfeebene im dorsalen Bereich liegt. Die Pfeile in E zeigen die Ansatzmuskulatur der Borsten, die sogenannten Borstentaschen. Diese fehlen im Bild F.

Man kann also davon ausgehen das Delta+Notch mit der Differenzierung der Borsten zu tun hat. Was natürlich schon bekannt ist, aber das ganze dient ja zu meinen Ausbildungszwecken. :)

Schönen Gruß,
Jan

Hallo Jan!

Tolle fotos, sehr interessanter Beitrag!

Bei welcher Anregungungsfrequenz fluoresziert der Farbstoff?

Liebe Grüße

Franz

Hallo Franz,

vielen Dank für das Lob.

Der im letzen Beitrag verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist Fluorescein isothiocyanate (FITC), angeregt bei 495 nm, Emission bei 521 nm.

Schönen Gruß,
Jan

Hallo Jan!

Hey, da kann man ja sogar ohne Hg-Dampf mit "Blaulicht arbeiten!

Ich finde es toll, dass Du so ambitioniert Dein Studium betreibst! Wie mein älterer Sohn! :-))

Liebe Grüße aus Österreich

Franz