Nutzung von Leitz ICT-Objektiven im Hellfeld

[ortholux]

Liebe Kollegen,

die Vereinigung der beiden Strahlen findet im Analysator statt.

Was sehen wir im DIK? Ein reliefartiges Bild. Dieser Eindruck kommt zustande indem an der einen Seite des Objektes ein heller Streifen auf der anderen ein dunkler Streifen erscheint.
Wie kommen diese Streifen zustande? Durch Interferenz. Auf der einen Seite geht z.B. der linke Strahl durchs Medium auf der anderen Seite der rechte. Es wird also einmal der linke, einmal der rechte Strahl - oder besser Wellenzug - abgebremst. Das führt in der Interferenz im besten Fall zu einer Amplitudenverstärkung auf der anderen zu einer Abschwächung (hell, dunkel)

Interferieren können aber nur Wellenzüge, die gleich polarisiert sind. Und das sind sie im Prisma noch nicht. Erst im Analysator werden die beide Wellenzüge vektormäßig zerlegt, wodurch die gleich orientierten Anteile interferieren können.

Raphael,
natürlich verschwindet Licht nicht einfach so im Äther. Es wird an der Tubuswand absorbiert oder vagabundiert als Streulicht darin herum.

Diese definierte Aufspaltung funktioniert unabhängig von der Art des zur Beleuchtung eingesetzten Lichtes.

Das stimmt so pauschal nicht. Nur wenn das beleuchtende Licht polarisiert ist und die Schwingenungsrichtung 45° zu den Schwingungsrichtungen des Prismas orientiert ist, gibt es eine definierte Aufspaltung in zwei Teilstrahlen. Und auch nur dann, wenn der beleuchtende Wellenzug parallel zur optischen Achse verläuft.

All das bietet die Hellfeldbeleuchtung nicht. Deshalb mag es wohl irgendeine Ablenkung geben, und wenn die Probe anisotrop ist, sogar eine gewisse (undefinierte) Aufspaltung, aber nie zwei Bilder.

Verbesserungen erwünscht!
Wolfgang

[Piper]

Hallo,

noch mal kurz zurück zur ursprünglich gestellten Frage.
Werksseitig wuden die vom Kunden ausgewählten ICT-Objektive für die Interferenzkontrast-Eirichtung T zusammen mit dem zugehörigen Kondensor als "Set" ausgeliefert, wobei die Objektive vorzentriert und im zugehörigen Wechslrevolver so fest verschraubt waren, dass sie nicht ohne größeren Aufwand abgeschraubt werden konnten.
Gängig waren Kombinationen von 16, 40, 100x oder 25,40, 100x, auf Kundenwunsch auch 16, 25, 40, 100x.
Folglich waren am zugehörigen Fünffach-Objektivrevover noch ein oder zwei Stellen frei, die man mit Phasenkontrast- oder Hellfeldobjektiven bestücken konnte.

Die werksseitige Empfehlung, die ICT-Objektive am Revolver zu belassen und eine Serie von Hellfeld-Objektiven an einem anderen Revolöver zu verwenden, ist m.W. nur dadurch begründet, dass man dem Kunden im Falle eines Demontierens eine ggf. aufwendige Neuzentrierung der ICT-Objektive ersparen wollte. Wer also neben den ICT Objektiven weitere Objektive benutzen wollte, z.B. für Hellfeld oder spannungsfreie für Polarisation, oder mit Irisblende für Dunkelfeld, der sollte möglichst einen separaten Objektivrevolver verwenden, damit die ICT-Objektive ihre Zentrierung behalten.

M.W. hat diese Empfehlung nichts damit zu tun, dass man mit den ICT-Objektiven kein gutes Hellfeldbild erzeugen könnte. Für Hellfeld empfielt Leitz gemäß Anleitung eine Stellung des Analysator-Schiebers in Position des schrägen Doppelpfeils, zusätzlich natürlich am Kondensor die Position "H". Das so erhältliche Hellfeldbild ist einwandfrei und steht den mit Standard-Hellfeldobjektiven erzeugten Bildern m.E. in nichts nach, zumindest unter Aspekten der praktischen Anwendung.

Viel Freude an der schönen ICT-Einrichtung!

Jörg Piper

[JB]

Hallo,

Die Empfehlung, DIC Prismen fuer Hellfeldbenutzung zu entfernen, glaube ich in Bedienungsanleitungen gelesen zu haben, kann sie aber derzeit nicht wiederfinden.

In der Literatur finden sich hauptsaechlich Angaben zur Vereinbarkeit von DIC und Fluoreszenz. Auch da sind die Doppelbilder nachweisbar. Da in der Konfokalmikroskopie PSFs experimentell bestimmt werden, sind die Doppelbilder den Nutzern nicht entgangen. Aus diesem Grund wird auch die Kombination Phasenkontrast+Fluoreszenz statt DIC bevorzugt.

Hier finden sich harte Daten:

Zucker, R.M. (2005) Evaluation of Confocal Microscopy System Performance. Cell Imaging Techniques. Douglas Targets ed. Humana Press Chapter 5 77-135

4.23. Interference Contrast and Confocal
Interference contrast is a very useful parameter in microscopy and it can be
combined with fluorescence. However, because the microscope system was
designed for light to traverse through two interference filters, when this optical
system is applied to a confocal microscope there is distortion in the fluorescence
signals. The fluorescent light traverses the interference contrast filter and
excites the sample, and then the emitted fluorescence travels back down
through the same interference contrast filter and back through the scan head.
The resulting image shows a duplication of very small particles (0.17 μm, PSF
beads) and a distortion of larger particles. PSF beads show two spots and 0.5 μm
beads show an egg shaped image instead of a round image. The same distortion
that is observed on beads will occur on biological structures in cells (see Fig.
15). For optimum resolution of data that will be deconvoluted later, it is recommended
to remove the interference filters when acquiring an image.

Die Fluoreszenz-Emission ist unpolarisiert; verhaelt sich also genau so wie ein Hellfeldbild.

An motorisierten Fluoreszenzmikroskopen wird das DIC Prisma im Fluoreszenzmodus automatisch entfernt:

"Matching DIC prisms are moved into the light path when changing objectives; in fluorescence mode the DIC prisms are automatically removed from the light path to obtain best image quality."
http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-af6000/news/

Und noch eine Diskussion zu dem Thema:
http://confocal-microscopy-list.588098.n2.nabble.com/PSF-with-DIC-td3781952.html

Jon

[ortholux]

Lieber Jon,

du zitierst "LEICA"-Quellen. Bei Leitz war es damals nicht möglich, die Prismen zu entfernen (Smith im Gegensatz zu Nomarski).
Auch wenn es sogar eine handvoll Nomarskis von Leitz gab.

Wolfgang

[JB]

Lieber Jon,

du zitierst "LEICA"-Quellen. Bei Leitz war es damals nicht möglich, die Prismen zu entfernen (Smith im Gegensatz zu Nomarski).
Auch wenn es sogar eine handvoll Nomarskis von Leitz gab.

Wolfgang

Hallo Wolfgang,

Ich versuche eine Antowrt auf die Frage zu finden, ob der Verbleib der objektivseitigen Prismen im Hellfeld zu einer (wenn auch geringfuegigen) Verschlechterung der Bildqualitaet fuehrt.

Leider habe ich dazu bei Leitz keine direkten Angaben gefunden (die Litertur ist schwer zugaenglich). Es sollte aber unerheblich sein, ob Wollaston-Prismen oder Nomarski-Prismen verwendet wurden, denn entscheidend ist das Ausmass der Bildaufspaltung in der Objektebene.

Ich habe eine Literaturstelle gefunden, die echte Messwerte zeigt (Zucker, 2005). Ausserdem ist das Entfernen der Prismen gaengige Praxis (die beiden anderen Links). Natuerlich handelt es sich dabei um Nomarski-Prismen, denn die sind heutzutage gaengig.

Beim Leitz Smith-T waren die Prismen fest im Objektiv verbaut, vermutlich weil dort ein Wollaston-Prisma direkt in die hintere Brennebene des Objektivs eingebracht wurde (um das Nomarski-Patent zu umgehen??). Dementsprechend kann es fuer Hellfeldbeobachtung hier nicht herausgezogen werden. Also belaesst man es wo es ist (der Effekt auf das Hellfeldbild ist ohnehin gering), oder man tauscht die Objektive durch Revolverwechsel ganz aus.

Beste Gruesse,

Jon

P.S.: Gibt es in den "Leitz Mitteilungen für Wissenschaft und Technik" genauere Angaben zu den verschiedenen Interferenzkontrastsystemen von Leitz? Das wuerde mich sehr interessieren.

[Piper]

Hallo,

noch ein kleiner Nachtrag zu den "Doppelbildern" im Hellfeld, bezogen auf den Interferenzkontrast nach Smith (= Leitz  Interferenzkontrast T). Tatsächlich gibt es bei korrekter Anwendung im Hellfeld keine Doppelbilder, weil nur eines der beiden Bilder in den Beobachtungsstrahlengang gelangt und das andere Bild oberhalb des Objektivs durch den dort befindlichen "Hellfeld-Analysator" geblockt wird.

Im ICT-Kondensor befindet sich in der Position "H" natürlich kein DIC- (=Wollaston)-Prisma im Strahlengang.
Anders verhält es sich beim ICT-Objektiv, weil ja dieses ein fest eingebautes Wollaston-Prisma in dessen hinteren Brennebene beinhaltet.

Die Strahlen, welche innerhalb des ICT-Objektivs zum dortigen Wollaston-Prisma gelangen, werden dort bei Hellfeldbeleuchtung in zwei separierte und leicht zueinander verschobene Teilstrahlenbündel aufgespalten., welche zwei Teilbilder generieren, deren Verschiebung, zumindest in der Theorie, unterhalb der Auflösungsgrenze des jeweiligen Objektivs liegen soll. Entscheidend ist für die Hellfeld-Beobachtung, dass die beiden Teilstrahlenbündel, welche durch Aufspaltung im objektivseitigen Wollaston-Prisma entstehen, senkrecht zueinander polarisiert sind.

Der originale ICT-Schieber, der anstelle eines herkömmlichen Analysators oberhalb des Objektivs in den Strahlengang eingeschoben wird, beinhaltet zwei separate, paarig nebeneinander angeordnete Analysatoren, welche unterschiedlich ausgerichtet sind, d.h. verschiedene Schwingungsebenen polarisierten Lichts passieren lassen. Für Hellfeld-Beobachtungen soll, abweichend von der Einstellung für Interferenzkontrast, der anders orientierte Analysator verwendet werden, der mit einem schrägen Pfeil markiert ist. Dieser Analysator ist so orientiert, dass er senkrecht zur Schwingungsebene eines der Teilstrahlenbündel steht und somit eines der beiden Teilbilder ausblendet. Daher gibt es bei korrekter Anwendung im Hellfeld kein Doppelbild-Problem, wenn die Interferenzkontrast-Einrichtung komplett ist und der originale Schieber mit beiden Analysatoren zur Verfügung steht. Nur ein Bild wird zur Zwischenbildebene "durchgelassen".

Wenn man vor dem Mikroskop steht, mit Blick auf den Objektivrevolver, dann verläuft der Doppelpfeil des "Hellfeld-Analysators", welcher die hindurch gelassene Schwingungsebene markiert, in 45 Grad von links unten nach rechts oben. Der daneben befindliche Analysator für Interferenzkontrast (ICT) ist hingegen mit einem Doppelpfeil markiert, der von vorne nach hinten zeigt. Wer also keinen originalen Doppelschieber mit zwei unterschiedlich orientierten Analysatoren hat, könnte sich mit etwas handwerklichem Geschick auch aus zwei einfachen Analysator-Schiebern entsprechende Analysatoren bauen, einen für ICT und einen für Hellfeld, wenn er den jeweiligen einzelnen Analysator in seiner Fassung so verdreht, dass dessen Orientierung "stimmt".

Ergänzender Hinweis zur Historie bzw. zur Erfindungsreihenfolge:
Das Wollaston-Prisma wurde m.W. zuerst erfunden, und Smith beschrieb sein Verfahren in 1947. In den fünfziger Jahren, d.h. etwas später, entwickelte Nomarski das Wollaston-Prisma zum Nomarski-Prisma weiter und baute hierauf seine Version des Interferenzkontrasts auf. Smith war also vor Nomarski. Zeiss hat das Nomarski-Verfahren zur Marktreife gebracht und Leitz die Smith-Variante.

Schöne interferierende Grüße

Jörg Piper

[Rene]

Hello all,

Just to add a practical touch to this discussion, I've made some comparison images. Normal Nomarski DIC though, unfortunately I do not have access to the Smith system. Someone might be willing to repeat this with the Leitz stuff though.

These images are made on an Olympus inverted IMT-2. Objective: 20x splanapo NA 0.7; condenser NA 0.55. Test specimen: Pleurosigma angulatum (Z-Rax; Klaus Kemp slide), Camera: 2.5" 5Mp cmos TIS, via 0.75x relay. Image 'resolution' 70 pixels/10um, straight from the camera (jpg), no post processing. Focussed 'live', trying to capture the striae structure on the valve with maximum detail.

The DIC system consist of 4 parts, coded here: Wobj (objective Wollaston prism) or Wcond (condenser prism), Ana (polarizer above the objective) and Pol (polarizer before the condenser entrance). Additionally, the Analyzer can be adjusted to 45 degrees from the normal position, denoted as Ana45o. Following combinations are shown:
1 BF
2 DIC
3 Wobj+Ana+Wcond
4 Wobj+Wcond+Pol
5 Wobj
6 Wobj+Pol
7 Wobj+Ana
8 Wobj+Ana45o
9 Wobj+Ana45o+Wcond
10 Wobj+Ana45o+Wcond+Pol

1. Golden standard:  Brightfield:


2. Full DIC, not as great as BF, but still ok:


3. Removing the Polarizer only:


4. Removing the Analyzer only:


5. Only the objective Wollaston in place:


6. objective Wollaston + condenser polarizer only:


7. Objective Wollaston + analyzer only:


8. Objective Wollaston + analyzer, turned 45 degrees:


9. Objective Wollaston + analyzer turned 45o + condenser polarizer:


10. All DIC components but with analyzer turned 45o:



Theoretical discussion appreciated, best wishes,

René

[Klaus Herrmann]

Hallo René,

sehr schöner systematischer Vergleich mit einem  - wie ich finde immer schwierigen Testobjekt.
Ergebnisse sind  doch ganz ok. Nur eines kann ich nicht verstehen Das DIC-Ergebnis hätte ich deutlich besser erwartet. Die sieht hier ja richtig matschig aus.

[JB]

Hi Rene,

Thanks, that was a lot of work. However, I can barely see anything of the striations; everything is plain grey on my screen. What is your interpretation of what you see, since you have the original images? Or could you increase the contrast a bit and show small snippets side-by-side? At the moment it's hard compare across 10 large images.

Jon

[JB]

Für Hellfeld-Beobachtungen soll, abweichend von der Einstellung für Interferenzkontrast, der anders orientierte Analysator verwendet werden, der mit einem schrägen Pfeil markiert ist. Dieser Analysator ist so orientiert, dass er senkrecht zur Schwingungsebene eines der Teilstrahlenbündel steht und somit eines der beiden Teilbilder ausblendet. Daher gibt es bei korrekter Anwendung im Hellfeld kein Doppelbild-Problem, wenn die Interferenzkontrast-Einrichtung komplett ist und der originale Schieber mit beiden Analysatoren zur Verfügung steht. Nur ein Bild wird zur Zwischenbildebene "durchgelassen".

Hallo Jörg,

Danke fuer die ausfuehliche Beschreibung. Da erschliesst sich auch der Sinn des doppelten Analysatorschiebers!

Jon

[Rene]

Hi John, as long as you see some structure in the BF image, you get the conclusion. The Wollaston prism for the objective has a directional blurring effect in brighfield. For correct brighrfield it can be neutralized with an analyzer in the pathway, which needs however to be shifted 45 degrees from the normal direction, highly impractical and it takes that last edge of the contrast of the lens in any case. Adjust contrast on the first and last image, and you'll see what I mean.

Klaus, thanks. This is an inverted DIC system, the shearing might be larger than for an upright. So the DIC image probably looks better in an upright scope with 40x lens. I will see if I can find out more about the shearing characteristics for this system.

Best wishes, René