Erste Versuche Paraffineinbettung

[Olaf Kossek]

Hallo Forum

Als ein Schwertträger (Xiphophurus helleri) in meinem Aquarium starb, hatte ich "Material" für erste Versuche mit Paraffineinbettung. Außerdem wollte ich herausfinden, woran der Fisch gestorben ist. Also wurde eine Sektion durchgeführt, die jedoch bei makroskopischer Kontrolle außer einer hellen Verfärbung kleinerer Bereiche der Kiemen nichts Besonderes ergab. Abstriche der Haut und Quetschpräparate der Leber wurden ebenfalls untersucht und waren ohne Befund. Einige Bereiche der Kiemen zeigten unter dem Mikroskop Einschmelzungen der Kiemenblätter und Ansammlungen von Bakterien.

Kiemenregion Xiphophorus helleri quer; ca. 40x

Bei der Herstellung der Präparate wurde verfahren, wie im Gerlach, Botanische Mikrotechnik, Thieme Verlag 1969 auf den Seiten 52 ff beschrieben. Dieses Verfahren ist zwar für botanische Materialen vorgesehen, aber mangels Alternativen habe ich es einfach mal probiert. Die Fixierung des in ca. 8mm dicke Scheiben geschnittenen Fisches erfolgte  mit AFE für 24 Stunden. Entwässerung über Alkoholstufen. Die Infiltration mit Paraffin wurde in mehreren Stufen mit Gemischen von Xylol und Paraffin in steigender Konzentration vorgenommen, bis die Präparate zuletzt in reinem Paraffin mit einem Schmelzpunkt von 56°C lagen. Es wurde ein selbstgebastelter Wärmeofen verwendet, der die Temperatur bei 60°C  mit einer Toleranz von 0,5 °C konstant hielt. Für die Einbettung habe ich mir Papierschälchen gebastelt, die Blöcke von etwa 10mm Kantenlänge ergaben. Die fertigen Blöcke wurden auf kleine Holzklötzchen aufgeschmolzen und mit dem Handmikrotom und einem Klingenhalter von Herrn Herrmann geschnitten. Soweit war das Ganze recht unproblematisch.

Die Schnitte wurden mit Xylol entparaffiniert und mit frisch angesetztem Glycerineiweiß auf die Präparateträger aufgeklebt. Und hier begannen die Probleme. Bei der nachfolgenden Färbung mit HE schwammen die meisten der Schnitte einfach davon - nur etwa 20% haben die Prozedur mehr schlecht als recht überstanden. Daher ist auch die Färbung nicht so gut gelungen. Die restliche Behandlung war Routine. Entwässern über Alkoholstufen und Einschluss in Euparal.

Wie man im Bild erkennen kann, sind im Bereich der Kiemen gelblich gefärbte Ansammlungen von Bakterien zu sehen. Im gezeigten Foto erscheint das zwar nicht so heftig, aber die verlorenen Schnitte zeigten, daß bis zu geschätzten 90% der Kiemenblätter zersetzt waren . Darum kann man wohl annehmen, daß die Ursache für das Ableben des Schwertträgers in einer bakteriellen Kiemeninfektion zu suchen ist.

Hat vielleicht jemand einen guten Tip parat, wie man das Abschwimmen der Schnitte sicher verhindern kann?

mit freundlichen Grüßen aus Augsburg
Olaf

[Jürgen H.]

Lieber Herr Kossek,

Wie haben Sie denn die Schnitte aufgeklebt? Mehrere Ursachen sind denkbar:

Der Objektträger sollte sauber und vor allem fettfrei sein.
Die Eiweiß/Glycschicht sollte sehr sehr dünn sein. Eine nadelkopfgroße Menge reicht. Sie sollte mit einer absolut fettfreien Fingerbeere verstrichen werden
Sodann beschichte ich den Objektträger gleichmäßig mit abgekochtem entmineralisiertem Wasser und lege ihn auf ein Wärmebänkchen bei nicht mehr als 40 Grad,  sonst zerreißen die Schnitte. Auf das warme Wasser werden die Schnitte aufgebracht. Die Schnitte müssen mit der glänzenden Seite nach unten aufgelegt werden und sich auf dem Wasser gut strecken.
Wenn das Wasser abgelaufen oder abgetrocknet ist, muss der Schnitt auf dem Objektträger noch trocknen. Ich vermute dass der Fehler hier liegt. Er sollte noch mal in den Wärmeschrank, das Paraffin darf hierbei aber nicht schmelzen.

Sodann sollte der Schnitt halten.

Mikrogrüße

Jürgen Harst

[Olaf Kossek]

Hallo Herr Harst,

Der Objektträger wurde mit Alkohol und danach mit Xylol gereinigt und sollte damit eigentlich fettfrei sein. Eiweißgycerin wurde wie empfohlen nur sehr dünn aufgetragen und mit der alkoholgereinigten Fingerkuppe verstrichen. Als Wasser habe ich normales dest. Wasser verwendet und die Präparate zum Strecken nochmal in den Wärmeschrank gelegt. Aber die Temperatur hatte ich deutlich über 50°C eingestellt - gerade unterhalb des Schmelzpunkts vom Paraffin. Die Schnitte sollten also auf jeden Fall gut durchgetrocknet worden sein. Nun ja, eine eindeutige Ursache kann ich nicht erkennen aber für den ersten Versuch war es doch schon mal ermutigend. Inzwischen habe ich auch noch einige Versuche mit einer ordinären Hausfliege gemacht (sie hat mich mit wachsender Begeisterung geärgert - das führte dazu, dass sie als Präparateserie endete)  Dabei kam eine härtere Paraffinsorte mit 60 °C Schmelzpunkt zur Anwendung und selbst das Chitin liess sich mit diesen einfachen Mitteln ohne größere Probleme schneiden.

Bei weiteren Versuchen (die ganz sicher kommen werden) kann ich ja noch Erfahrungen sammeln und eine gewisse Routine erwerben. Wenn es dann irgendwann einmal recht sicher mit der Paraffineinbettung klappt, kann ich mein mikroskopisches Betätigungsfeld deutlich erweitern.

mit freundlichen Grüßen aus Augsburg

Olaf

[Detlef Kramer]

Hallo,

was mir aufgefallen ist, was aber möglicherweise schon ausgeräumt ist: die Reihenfolge stimmte nicht. Die Schnitte müssen erst aufgeklebt und dann entparaffiniert werden.

Viel Erfolg und herzliche Grüße

Detlef Kramer

[Jürgen H.]

Liebe Herr Kossek,

für meine Begriffe sind Ihre Versuche, soweit Sie sie hier eingestellt haben, sehrt gelungen. Dies wirklich vorweg. Ich habe lange gebraucht, dahin zu kommen.

Eine denkbare Fehlerquelle habe ich noch. Haben Sie sich einmal Ihre Objektträger mit dem aufgeklebten Paraffinschnitt vor dem Entparaffinieren unter dem Mikroskop angesehen? Möglicherweise sind dort unter dem Paraffin kleine Bläschen verblieben. Ich verwende daher abgekochtes entmineralisiertes Wasser. (Und verwende es natürlich nur lau)

Und noch eines: Sie haben den Schnitt nach Xylol in die Alkoholstufen abwärts gebracht in aqua dest und dann in Hämalaun? Und die Stammlösung verdünnt angewendet? Welches Hämalaun haben Sie denn benutzt?

Mikrogrüße

Jürgen Harst


P.S. Wie haben Sie denn den Paraffinofen selbst gebastelt?

[K. Koch]

Hallo Herr Kossek,
vielleicht kann man Superfrost-Objektträger statt Glycerineiweiß verwenden? Habe ich allerdings selber noch nicht ausprobiert, aber im "Werbetext" steht, dass die Schnitte aufgrund von elektrostatischer Anziehung drauf haften. Z.B. "Objektträger SuperFrost®/Plus".

Bei Pflanzenschnitten habe ich einfach die Schnitte mit einem schachtelfrischen, unbehandelten normalen Objektträger aus dem Streckbad gefischt, auf der Heizplatte trocknen lassen, und dann weiterverarbeitet. Dass die Schnitte dann wegschwimmen ist mir sehr selten passiert...

Ach ja: Sehr schönes Foto!

Viele Grüße
K. Koch

[Olaf Kossek]

Hallo,

zuerst einmal vielen Dank für eure Meinungen.

@ Herr Kramer - ja, die Schnitte wurden vor der Entparaffinierung aufgeklebt. Im Text habe ich mich da einfach unklar ausgedrückt.

@ Herr Harst - Die von ihnen angeführte Fehlerquelle werde ich beim nächsten Versuch beachten. Eine mikroskopische Kontrolle auf eingeschlossene Luftbläschen erfolgte nicht und ich habe auch einfach dest. Wasser aus der Flasche bei Zimmertemperatur verwendet. Vielleicht liegt ja hier eine Ursache ... Zur Färbung habe ich eine Fertiglösung von Biologie-Bedarf Thorns in Göttingen verwendet. Über den genauen Ansatz kann ich darum nichts sagen.

Der Wärmeofen ist ein uralter Wärmeschrank (wohl aus den 60er Jahren), den ich mal in defektem Zustand bei ebay ersteigert habe. Das Heizelement war noch in Ordnung und so habe ich mir eine Regelschaltung von Conrad etwas umgebastelt, um den Ofen wieder benutzen zu können. In der Mitte des beheizbaren Raumes liegt die Temperaturkonstanz etwa bei + - 0,5°C wenn man lange genug (etwa 1 - 2 Stunden) vorheizt, so daß sich die Temperatur einpegeln kann. Die Langzeitstabilität über mehrere Tage liegt laut elektronischem Thermometer ebenfalls in diesem Bereich. Erreicht wurde das durch die Anordnung von zwei getrennten Sensoren an in endlosen Versuchen ermittelten Stellen. Der Wert des Sensors, der nahe am Heizelement liegt, wird benutzt, um die Heizphase zu beenden. Der Sensor in der Mitte schaltet bei Unterschreitung der eingestellten Temperatur das Heizelement wieder ein. Dadurch kann man mit einfachen Mitteln die Schalthysterese verkleinern. Die restlichen Schwankungen wären wohl nur durch sehr aufwendige Maßnahmen zu eliminieren. Da die Genauigkeit für meine Zwecke mehr als ausreichend ist, habe ich weitere Basteleien gelassen und bin mit meinem "Öfchen" zufrieden. Die kleinste regelbare Temperatur liegt bei 30°C und die höchste bei über 100° - die habe ich aber noch nie probiert.

@ Herr Koch - Von diesen Objektträgern habe ich auch schon gelesen. Möglicherweise wäre es mal einen Versuch wert. Aber ich frage mich immer, wie es die Mikroskopiker vor einigen Jahren, als es diese Objektträger noch nicht gab, geschafft haben, ihre Präparate anzufertigen. Also muss es doch auch mit normalen Trägern gehen und das will ich auch hinbekommen. (Außerdem habe ich einen riesigen Vorrat an normalen Objektträgern)

mit freundlichen Grüßen aus Augsburg
Olaf

[Jürgen H.]

Lieber Herr Kossek,

Die Superfrostobjektträger habe ich schon einmal benutzt. Und um mich vorsichtig auszudrücken: Einfach so hat das mit denen bei mir jedenfalls nicht geklappt.

Sie benutzen also das Hämalaun nach Ehrlich. Sehen Sie sich einmal an, was geschieht, wenn Sie ein paar Tropfen davon in etwas Wasser träufeln.  Das dürfte etwas Turbulenzen geben. Diese Variante besteht nämlich in etwa zu einem Drittel aus Äthanol, zu einem anderen Drittel aus Glycerin. Das Originalrezept finden Sie z.B. hier:

http://www.aeisner.de/

Möglicherweise ziehen diese Turbulenzen Ihnen  die gewässerten Schnitte vom Objektträger. Versuchen Sie einmal, die Hämalaunlösung mit aqua dest. etwas zu verdünnen, 1/1 oder 1/2, die Farbe darf dabei nicht umschlagen. Und verwenden Sie dann die dünnere Lösung mit einer etwas längeren Färbezeit.

Vielen Dank für Ihre Schilderung Ihres Wärmeofens!

Mikrogrüße

Jürgen Harst

[Olaf Kossek]

Guten Abend Herr Harst,

ich habe soeben den von ihnen vorgeschlagenen Test gemacht - Volltreffer. Deutliche Turbulenzen sind zu sehen und die vorher aufgebrachte dünne Wasserschicht wird schlagartig verdrängt. Also scheint die Ursache gefunden. Wenn jetzt nicht gerade Weihnachten vor der Tür stände.... Aber der häusliche Frieden soll gewahrt bleiben und so werde ich erst zwischen den Feiertagen einen erneuten Versuch mit verdünnter Färbelösung starten. Über die Ergebnisse werde ich hier berichten.

Vielen Dank auch für den Hinweis, daß es mit den beschichteten Objektträgern auch nicht "mal eben so" funktioniert. Den Test kann ich mir also sparen.

Allen im Forum wünsche ich einen schönen 4. Advent und ein ruhiges Weihnachtsfest

mit freundlichen Grüßen aus Augsburg
Olaf