Syphatiaeier in Probe

[mm4882]

Hallo,

habe in der letzten Kotprobe Sypthatiaeier gefunden. Anfangs konnte ich sie nicht einwandfrei zuordnen, ein "Fachmann" hat mir aber geholfen. Da die Probe (nativ) jedoch ca 3-4 Wochen am Objektträger war (eingetrocknet), meine er, dass sie in einem sehr schlechten Zustand sind (siehe Foto anbei). Wie kann ich so ein Präperat "haltbar" machen, da ich vor habe, diese auch anderen zu zeigen (zB Vortrag).


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Man beachte, dass das Foto von einer Handykamera (Ericsson) mit dem Indermikroskop aufgenommen wurde - und ich nicht dachte, dass das funktioniert  

LG

Martin

[Detlef Kramer]

Lieber Martin

sei mir bitte nicht böse, aber ich antworte mal auf die etwas verpönte Art: Die Anfertigung von Dauerpräparaten ist ein sehr komplexes Gebiet. Das kann man m.E. nicht in ein paar Sätzen abhandeln. Für mich kommt noch hinzu, dass dieses Gebiet mir völlig fremd ist.

Also, lies doch einmal die entsprechenden Kapitel in der Mikrofibel (link oben, rechts von der Mitte), zu Detail-Fragen können wir dann immer noch die Antworten finden.

So ganz aus dem Bauch: versuch es mit Glycerin-Gelatine (z.B.von http://www.chemlab.at/). Das geht ganz einfach, ohne Entwässern.

Gruß

Detlef

[mm4882]

Hallo,

danke, die Mikrofibel habe ich schon ausgedruckt und gelesen. Mir ist schon klar, dass dies nicht so einfach ist - werde mir aber das Kapitel noch mehrmals durchlesen.

Meine konkrete Frage war ja, kann man es so "präparieren" dass die Eier dieses Wurmes (Nager) - oder zB auch Flagellaten und andere Parasitendauerstadien weder ezystieren, noch sich sonst wie verändern oder absterben, sodass ich nicht immer gleich ein Foto machen muss, sondern ev. Leuten das Präperat direkt zeigen kann.

Chemlab kenne ich - danke für den Hinweis - dort habe ich Methylenblau, Karbolfuchsin und 3% Salzsäurealkohol her für Färbungen.

LG

Martin

[Ralf Feller]

Hallo Martin,
es ist einfacher die Kotprobe zu konservieren. Ich gebe immer einige Tropfen oder ml 37% Formalin dazu
(9 Volteile Stuhl + 1 Teil 37% Formalin). Wurmeier lassen sich dann in der Aufschwämmung immer wieder wie im Frischpräparat mikroskopieren. Wie Detlef auch schreibt,kann man auch Glyceringelatine nehmen, die Eier sollten aber fixiert sein und werden dann mit Glycerin präpariert. Fixierte Stuhlprobe mit einigen Tropfen Glycerin versetzen, in einer offenen Schale Flüssigkeit verdampfen lassen bis das ganze nur noch in Glycerin schwimmt, dann in erwärmte Glyceringelatine => Objektträger => Deckglas mit Nagellack abdichten. Wenn man Glück hat, ist das Präparat stabil und trocknet nicht aus. Viel einfacher ist es, wie gesagt, die ganze Probe mit Formalin fixiert in einem kleinen Röhrchen aufzubewahren.

Gruß Ralf

[Alfons Renz]

Hallo Martin,

Eine einfache und allgemein gültige Methode, um Wurmeiner, Flagellaten und 'andere Parasitendauerstadien' für die Mikroskopie zu konservieren, gibt es nicht: Die Fixierung mit Formalin, wie Herr Feller sie beschreibt, ist zwar ein probates Mittel für Dauerstadien aller Art, aber Flagellaten werden danach kaum mehr zu erkennen sein.

Syphacia (so heissen diese Oxyuriden) Eier lassen sich durch Flottationsverfahren aus dem Kot anreichern - manche Arten legen ihre Eier auch im Perianalbereich ab und sind dann dort zu suchen. Beim Anfertigen von Dauerpräparaten ist zu beachten, dass die Einbettungsmittel oft nur schwer durch die derbe Cuticula eindringen und die Eier dann kollabieren oder nach der Einbettung Luft 'ansaugen', d.h. schwarz werden.

Sie müssen also für jede Art von Parasiten ein eigenes Anreicherungs- und Fixierungsverfahren verwenden, und dann für spätere Präsentationszwecke Dauerpräparate anlegen.  Flagellaten lassen sich im Ausstrich spezifisch anfärben (Giemsa ist immer zu empfehlen).

Glyceringelatine hält einige Jahre bis Jahrzehnte, aber nicht 'ewig'. Ebenso Einbettungen mit Polyvinyllactophenol etc. Man merkt das selbst schneller als gedacht. Wirklich dauerhaft sind nur sorgfältig entwässerte und in einem geeigneten Harz eingebettete Präparate (näheres dazu in der Mikrofibel).

Auf einem fest eingebetteten Präparate sollten Sie die 'schönsten' Objekte mit einem Filzschreiber (oder Diamant) markieren und so immer wieder sofort auffinden, wenn Sie es zeigen möchten. Parasiten - und viele andere Objekte - neigen dazu, sich just in dem Moment unsichtbar zu machen, wenn Sie diese einer größeren Zuschauerschar vorführen möchten. Bei Objekten, die mit Immersion betrachtet werden müssen (Flagellaten) empfiehlt sich eine Markierung auf der Unterseite des Objektträgers oder ein geeigneter (Öl- und Xylol-fester) Lack (drei winzige Punkte genügen).

Mit besten Grüßen wünsche ich Ihnen viel Erfolg bei der Parasitenjagd,

Alfons Renz

[Ralf Feller]

Lieber Herr Renz,
ich habe immer einmal wieder versucht Flagellaten und Ciliaten zu fixieren und zu färben. Bei Blutparasiten wie Typhanosomen und Leishmanien gelingt mir das auch immer gut. Schon bei Giardia sind die Ergebnisse bescheidener. Darm- und Wasserciliaten konnte ich nie so darstellen. Besonders Wasserciliaten wurden schon beim trocknen der Ausstriche zerstört (und ich hätte so gerne mal ein schönes Giemsapräparat von einem Pantoffeltierchen gehabt).
Kennen Sie einen Trick? Flüssigfixierung, Fixierung der feuchten Ausstriche im Formalindampf, fixieren und färben der trockenen Ausstriche, nichts half. Aber vielleicht geht es ja nicht? Auch die tollen Aufnahmen von Martin Kreuz sind ja allesamt von Lebendpräparaten.

Gruß aus dem Ruhrgebiet, Ralf Feller

[Alfons Renz]

Lieber Herr Feller,

Mit der Fixierung und Färbung von Ciliaten habe ich wenig / keine eigenen Erfahrungen und kann daher nur auf die Empfehlungen der jeweiligen Spezialisten verweisen (z.B. im Mikrokosmos).

Generell und speziell in Bezug auf 'meine' Studienobjekte, die Mikrofilarien, habe ich die Erfahrung gemacht, dass das Geheimnis guter Fixierung auf einem entweder sehr dünnen und schnellen (Blut-)Ausstrich bzw. einer Überführung der Objekte in (wenig) destilliertes Wasser beruht. Ist nämlich das 'Medium', in dem sich die Organismen befinden, zu 'dick' (Serum, Darmflüssigkeit o.ä.), so enthält es viele Salze, die beim langsamen Eintrocknen den Mikroorganismen Wasser entziehen und sie dadurch völlig verschrumpeln lassen.

Mikrofilarien fische ich z.B. mit einer spitzen Nadel aus der 'Brühe' (Kochsalzlösung) und überführe sie in einen winzigen Tropfen aqua dest. auf einem separaten Objektträger. Nach dem Eintrocknen markiere ich die Stelle mit einem Diamantschreiber und färbe die Mikrofilarien mit Hämalaun oder Giemsa. Danach Einbettung mit Xylol / Harz (Eukitt o.ä.). Im Resultat sind die Mikrofilarien wie 'aufgebügelt', also breit mit deutlich separat liegenden Kernen.

Ich kann mir vorstellen, dass dieser Trick auch mit anderen Mikroorganismen funktioniert, die üblicherweise in physiologischen Medien mit hoher Salzkonzentration vorkommen oder isoliert werden.

Im Endeffekt ist es besser, nur einige wenige, aber schöne Objekte auf einem Objektträger zu haben, als viele völlig geschrumpfte oder durch andere Strukturen überlagerte Organismen. Man muss nur die Stelle möglichst exakt markieren, um das spätere Auffinden zu erleichtern.

Mit besten Grüßen,

Alfons Renz

p.s. Sie schreiben, dass Sie auch Probleme beim Fixieren von (Süß-)Wasserorganismen hatten, bei denen die Salzkonzentration des Mediums wohl keine so wichtige Rolle spielen dürfte. Hier ist es dann darauf zu achten, dass die Objekte niemals austrocken, also alle Schritte der Fixierung, Färbung und Einbettung im Feuchten geschehen und die Entwässerung mit Alkohol sehr sehr vorsichtig erfolgt.

[mm4882]

Hallo,

danke für die ausführlichen Antworten. Eine Frage hätte ich da noch - als nicht gewerblicher bekommt man in der EU 37% Formaldehyd nicht ausgehändigt. Ich bekomme (habe) nur 20%iges (zB zum Einlegen von Vogelspinnen). Reicht das auch? Welches Mischverhältniss muss ich da beachten?


Möchte die S. Eier nicht direkt (Klebestreifen) nachweisen, sondern eben in Reptilienkotproben (Pseudoparasit). Habe zwar zu Selbsttests diverse Futterratten/mäuse getestet um zu sehen was so alles "verseucht" ist, aber mein "Gebiet" ist und bleiben die Reptilien/Vogelspinnen.

Kann man dieses Buch: http://www.amazon.de/gro%C3%9Fe-Kosmos-Buch-Mikroskopie-Bruno-Kremer/dp/3440089894/ref=sr_1_4?ie=UTF8&qid=1263040321&sr=8-4-spell für meine Fragen empfehlen, oder behandelt es die Thematik nicht?

LG

Martin

[Ralf Feller]

Hallo Martin,
natürlich reicht 20%iges Formalin. Ich verwende Endkonzentrationen zwischen 3% und 4%, also z.B. 1 Teil 20% Formalin + 4,5 Teile(Volumen abschätzen) Stuhlprobe. Wurmeier eventuell vorher anreichern.

Gruß Ralf

[mm4882]

Hallo,

so habe mir die Mikrofilbel nochmal angesehen, im Forum gesucht und im I-Net. Leider gibts keine konkreten Anweisungen (zB Stichwort Alkoholfixierung).

Glaube ich kann konkret fragen:

1.) Lt. Internet sollte die Fixierung in Alkohol reichen!? Wie genau mache ich dass (Objekträger einfach in ein Glas mit Alkohol, liegend/stehend ...)? Kurze Skizierung des Ablaufes wäre sehr nett, da ich mich hier wenig auskenne.

Dannach spühlen? Wie, in Wasserglas legen, mit Tropfen aus einer Pipette?

2.) Habe ich gelesen, dass die Gelatine etc. für Schnitte gedacht sind, glaube daher nicht, das ich es mir "antun" muss für Parasiteneier (zB Wurmeier wie oben abgebildet)!? Lassen wir mal die "schwierigen" Flagellata weg!

Es ist zu bedenken, dass ich das ganze nur 1-2x machen will, um ein Präperat zu erhalten (leider gibts die nicht so zum Kaufen, was ich schon versucht habe), dannach sehe ich mir immer nur frisch an und mache ev. Fotos.

3.) Demnächst bekomme ich inaktive Kryptosporidium parvum Oozysten in Pufferlösung - wie soll ich da vorgehen, wie oben?

LG

Martin