PEG-Schnitte

Killa84 · September 13, 2011, 19:35:37 NACHMITTAGS

Hallo ,

ich möchte gern die Blüte schneiden um anschließend Reservestoffe nachzuweisen. Ich weiss dass ich kein Paraffin benutzen kann bezüglich der Fettfärbung. Deswegen traue ich mich gerade an PEG heran.
Die EInbettung war einfach. Allerdings erfolgt die Schwierigkeit nach dem Schneiden. Beim Übergang ins Wasser zerfetzen mir die Schnitte. Gibt es da Tricks? AUch die Einreicherung mit etwas PEG nützt nichts.
Gibt es auch noch andere Möglichkeiten in der Einbettung um Fette darzustellen ?

Ich wäre euch sehr dankbar wenn Ihr mir helfen könntet.

Viele Grüße

Killa

Ralf · September 13, 2011, 20:43:31 NACHMITTAGS

Zitat von: Killa84 in September 13, 2011, 19:35:37 NACHMITTAGS
AUch die Einreicherung mit etwas PEG nützt nichts.

Hallo Killa,

das hätte ich jetzt empfohlen. Wenn der Zusatz von PEG nicht gewirkt hat, war es vielleicht zu wenig. Versuche ruhig mal eine relativ konzentrierte Lsg von PEG in Wasser, z.B 20% oder auch 30%.

Welches PEG genau hast du genommen? PEG 1500? Hast du dem PEG zu einbetten auch noch etwas Glycerin zugesetzt oder war es reines PEG?

Killa84 · September 14, 2011, 08:34:47 VORMITTAG

Hallo Ralf,

Zum Einbetten habe ich PEG 1500 genommen allerdings ohne Glycerin. Das Schneiden bereitet mir keine Probleme solang der Block kühl genug ist.Nach ca 15 min lege ich den Block zurück in den Eisschrank. Was bewirkt denn das Glycerin??

Das Wasser habe ich mit ein paar Tropfen PEG 400 versetzt. Ich werde die Lösung heute stärker ankonzentrieren.Danke für den Tip

Rawfoto · September 14, 2011, 19:25:29 NACHMITTAGS

Hi Killa84

Glycerin ==> damit das Schneiden leichter geht (Schmierung) ...

:-)

Gerhard

Ralf · September 14, 2011, 19:30:09 NACHMITTAGS

Hallo,

Glycerin bewirkt nach meiner Beobachtung, dass das PEG 1500 nicht so spröde ist und demzufolge beim schneiden nicht so leicht zerbröselt. Es dient quasi als Weichmacher. Insbesondere wenn man Mischungen aus PEG 1500 und PEG 2000 verwendet, macht sich dieser Effekt positiv bemerkbar.

Killa84 · September 15, 2011, 13:25:09 NACHMITTAGS

DANKE für den Tip. Da ich pures PEG1500 benutze, ist das Material nicht spröde, und lässt sich ganz gut schneiden.
Die "Schmiere" entsteht meiner Meinung nach wegen der hygroskopischen Eigenschaft.

Das Problem ligt bei mir nur in der Überführung in das Wasserbad. Auch die 30% Lösung half wenig. Ich habe nun den Schnitt auf ein Objektträger gelegt, und das 30% PEG-Wasser darüber getropft. Die Schnitte haben dann zwar viele Falten, allerdings zereißt der Schnitt nicht gleich.

Ich danke euch

Klaus Herrmann · September 15, 2011, 21:21:01 NACHMITTAGS

Hallo Killa,

nu wo dir geholfen ist musst du auch was zeigen!

Übrigens Gefrierschnitte wäre auch eine Möglichkeit. Wenn du Zugang zu einem Gefriermikrotom hast?

Killa84 · September 17, 2011, 11:54:42 VORMITTAG

Hi

Naja, so ganz geholfen ist mir leider noch nicht. Das Einbetten und Schneiden erfolgt mit PEG mühelos. Sobald ich den Schnitt in das 30% PEG-Wasser überführe zerfetzt mir leider immer der Schnitt.
Ich habe Zugang zu Gefriermikrotomen, allerdings handelt es sich ja um eine Blüte die dadurch eher "zerstört" wird.

Klaus Herrmann · September 17, 2011, 12:38:46 NACHMITTAGS

Hi Hi Killa,

und was ist, wenn du 60%ige PEG-Lösung wählst? Wenn der Schnitt noch im PEG ordentlich aussieht; du den dann auf den OT auflegst und 60%ige PEG drauftropfst könnte es doch gehen. Nicht umsonst hat man in der Histolgie auf- und absteigende Alkoholreihen.

A bisserl mehr Geduld junge Frau(?). Wissenschaft ist 80% Forscherschweiß

Mit der Technoviteinbettung ist aber ätherisches Öl und Fett perdu nach meiner Vorstellung? Es wird doch klassich fixiert, in Ethanolreihe entwässert....

Killa84 · September 17, 2011, 14:44:59 NACHMITTAGS

Zitat von: Klaus Herrmann in September 17, 2011, 12:38:46 NACHMITTAGS
Nicht umsonst hat man in der Histolgie auf- und absteigende Alkoholreihen.

Die Idee den Schnitt direkt auf den Objektträger zu legen und das PEG zu tröpfeln habe ich zueletzt angewandt. Mich ärgern allerdings die vielen Falten, die ich nicht herausgestreckt bekomme. Wenn der Schnitt dicker geschnitten wird (+/-8µm) habe ich zwar keine Falten mehr, allerdings eine viel zu dichte "Zelllandschaft".
Deswegen kam ich auf die nächste Idee mit der Kunststoffeinbettung.

Zitat von: Klaus Herrmann in September 17, 2011, 12:38:46 NACHMITTAGS
Mit der Technoviteinbettung ist aber ätherisches Öl und Fett perdu nach meiner Vorstellung? Es wird doch klassich fixiert, in Ethanolreihe entwässert....

Das Ethanol reagiert mit freien Fettsäuren zur Veresterung. Da es sich bei den Reservestoffen allerdngs um Triglyceride handelt, dürften die sich nicht herauslösen. Oder seh ich das falsch????Meine Wahl für PEG lag viel mehr aus dem Grund kein Xylol verwenden zu wollen...

Klaus Herrmann · September 17, 2011, 17:34:44 NACHMITTAGS

Liebe Killa,

ZitatDie 26 jährige Killa

da bist du ja ne ganz schön alte Schachtel

ich dachte du habest mit 16 Abi gemacht und studierst jetzt im 6. Semester

Zurück zum Ernst der Wissenschaft:

Freie Fettsäuren kommen in der Blüte sicher nicht vor, abgesehen davon verestern die mit Alkoholen bei RT nicht so schnell. Sicher sind Triglyceride nicht so leicht löslich in Ethanol. Aber die Duftstoffe einer Blüte, besonders bei Orchideen sind ziemlich komplexe Gemische. Ich hab mal mit Givaudan-Roure ein Projekt bearbeitet und dabei etwas Einblick bekommen in deren Forschung zur Aufklärung der Inhaltsstoffe von Duftkomponenten. Da hatte ich den Eindruck, dass ich von organischer Chemie nur eben mal die Grundlagen kenne

Ich habe etwas Bedenken, wenn du 8 µm dicke Schnitte machst bei nicht fixiertem pflanzlichem Gewebe - und dann auch noch zarte Blüten - hält das m. E. kaum. Was spricht denn gegen eine höhere Schnitt-Dicke? Die Chance, dann auch Vakuolen zu erwischen, die nicht aufgeschnitten - und dadurch ausgelaufen - sind, ist doch viel größer. Wenn du bei der Fotodokumentation stackst hast du auch eine 3D-Info, die beim 8 µm- Schnitt kaum erzielt werden kann.

ZitatIch bin sooo froh, dass ich euch hier habe. Ihr gebt mir die nötige Portion Geduld und Durchhaltevermögen.

Wir geben uns alle Mühe dich davon abzuhalten in tiefe Depression zu fallen, weil wir sonst ja nie ein Bild sehen werden!

Darf ich noch eine Frage stellen? Mir ist noch nicht richtig klar, wie die eigentliche Frage-/Aufgabenstellung lautet?
Kannst du bitte - wenn nicht ein staatstragendes Geheimnis dahinter steckt - noch ein wenig aus dem Schnibbelkästchen plaudern?

Killa84 · September 17, 2011, 19:56:58 NACHMITTAGS

Hi Klaus,
Da ich eine ausgebildete med.techn.Laborassistin bin, und zur Zeit studiere fragte mich mein Professor ob ich ihm nicht bei seiner Forschungsarbeit behilfrich wäre. Also mit deiner Vermutung ich sei eine "alte" Studentin liegst du sehr richtig.

Killa

Rawfoto · September 17, 2011, 20:23:35 NACHMITTAGS

Hi Killa

Ich frage mich gerade warum du dich gegen Paraffin sträubst, ich würde es an Deiner Stelle damit versuchen und 50% Bienenwachs dazu mischen. Wenn Du dann auch noch dicker schneidest solltest Du super Schnitte von Pflanzenteilen bekommen ...

:-)

Gerhard

Klaus Herrmann · September 17, 2011, 21:55:59 NACHMITTAGS

Hallo Killa,

na dann kann man den Prof wegen Kinderarbeit nicht dran kriegen - vielleicht "Sklavenausbeutung"?

Ich hab mal Rosmarinblätter geschnitten und bei relativ dicken Schnitten Drüsenzellen gefunden:

Bei der Venusfliegenfalle habe ich es anders gemacht: die Verdauungsdrüsen sind schwer auszumachen, deshalb habe ich keinen Scnitt gemacht, sondern Epidermis abgezogen, angefärbt und in der Aufsicht angeschaut. Noch eindrucksvoller war eine Auflicht-Fluoreszenzaufnahme - ungefärbt.

Da sieht man wunderschön die Verteilung. Und das ist doch das, was ihr sucht?

Stacken: Schichtaufnahmen. Man macht mehrere Aufnahmen der selben Stelle in steigenden Fokussierungen. Mit geeignetem Programm rechnet man dann ein tiefenscharfes Bild. Ich machs mit Helicon Focus. Es gibt viele Programme. Ich hab nur damit Erfahrung.