Paraffineinbettung welche Einwirkzeiten?

[Sascha D. F.]

Hallo liebe Mikroskopgemeinde,

ich hätte ein paar prinzipielle Fragen zu Zeiten bei histologischen und pflanzlichen Präparaten.
Einiges habe ich im Forum und Büchern gefunden, leider immer verschiedene Angaben zu den Einwirkzeiten. Diese schwanken je nach stufe von 2 h bis 24 h. könntet Ihr mir da Tipps geben?
prinzipielles Vorgehen mit Zeiten von Ronald. Kann man das evtl. abkürzen, welche Zeiten nehmt Ihr?
gibt es Unterschiede zwischen Pflanze und Tier?

1. Entnahme von Gewebe
2. Fixieren
           Carnoy C         Objekte von 1-2mm Dicke 1 Std. 3-5mm Dicke 3-5 Std., maximal 24 h
           AFE            mindestens 24 h
           70 % Ethanol        ?
           4 % Formalin        ?
3. Auswaschen
           Carnoy, AFE           90 % Ethanol 2 h
           Formalin              Wasser 24 h tropfendes Wasser
4. Entwässern/Einbetten        bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
          30% Ethanol          bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
          50% Ethanol          bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
          70% Ethanol         bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
          85% Ethanol          bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
hier für Carnoy / AFE fixiertes starten
          95% Ethanol          bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
         100% Isopropanol      bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
         100% Isopropanol trocken   bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
         Xylol/Ersatz         bis 5 x 5 x 5 mm 12h sonst 24 h
         Paraplast/Xylol/Ersatz    bis 5 x 5 x 5 mm 24 h sonst 48 h   Gefäß offen oder verschlossen?
         Paraplast 60 °C       bis 5 x 5 x 5 mm 24 h sonst 48 h, Gefäß offen
         Paraplast 60 °C       bis 5 x 5 x 5 mm 24 h sonst 48 h, Gefäß offen
5. Block gießen

[Ronald Schulte]

Danny,

Schau mal auf diese Website. So mache ich es auf jeden Fall aber natürlich kann man irgendwo was verkürzen.
Nachteil davon ist das früher oder später ein Punkt kommt wo die Zeiten zu kurz werden und dann ist erst beim Schneiden zu bemerken das alle Arbeit um sonst gewesen ist.
Die 12 Stunden Zyklus die ich gebrauche ist dann auch so gewählt das du die ganze Woche zur Arbeit gehen kannst und doch noch Histologie betreiben kannst. Wenn du den Wechsel so um 07.00 und 19.00 vornimmst wird es was angenehmer wie in z.B. 4 Stunden Zyklus und dann in die Nacht raus musst um das Gewebe zu wechseln.

Grüße Ronald

Link zu diese download-Website

[Sascha D. F.]

Hallo Ronald,
vielen Dank, dann werde ich dabei bleiben und aller 12h wechseln
LG
Danny

[Ronald Schulte]

Danny,

Natürlich kannst du mit kleinere Stücke die Zeiten richtig verkürzen aber es ist doch, meine Meinung, gerade so schön um einen Großschnitt zu machen um so den Zusammenhang von das Gewebe gut beobachten zu können! Mit diese gezeigte Blöcke müssen die Stufen einfach 24 Stunden sein sonst durchtränkt es nicht vollständig.







Grüße Ronald

[Sascha D. F.]

Hallo Ronald,

na da vertraue ich Dir voll und ganz, Du bist der Profi.
Noch ein paar Fragen habe ich:

In welchem Volumenverhältnis nimmst Du die Alkohol und Paraffinlösung zur Probe. Also sagen wir mal bei einem Probevolumen von 1 ml welches Mindestvolumen der Lösungen empfiehlst Du?

Und dann noch die Fragen mit dem Intermedium:
Bei der Mischung Intermedium mit Paraffin, ist da das Gefäß bei Dir verschlossen? oder lässt du das Xylen einfach offen abdampfen?

Ich habe ein Paraplast von Sherwood, das mischt sich gar nicht mit Isopropanol bei knapp 60°C obwohl ich dies noch extra über Trockenmittel getrocknet habe (als Chemiker ist das kein Problem). es sind 2 getrennte Phasen zu erkennen. Ich bin nun auf Orangenöl ausgewichen, Xylen mag ich nicht sonderlich, und brauch's nicht unbedingt in der Wohnung. Evtl. destilliere ich das Orangenöl noch einmal um die gelbe Farbe zu entfernen, andererseits müsste die im absteigenden Alkoholbad dann eh verschwinden, und das Objekt ist im Block besser sichtbar.

LG
Danny

[Ronald Schulte]

Danny,

Zuerst mal zum Profi: "ich bin ein Gans einfache Hobby-Histologe die Montags zum Flugplatz muss weil da die Arbeit ist!"

In welchem Volumenverhältnis nimmst Du die Alkohol und Paraffinlösung zur Probe?

Ich nehme von diesen Rostfreien Kaffeemilchbecher. Mindestvolumen weis ich also nicht. Ich argumentiere immer so das genügend Paraffin da sein muss um das Xylol zu vertreiben und dann ist mehr Paraffin besser wie weniger Paraffin. Im Ersten paraffinbad rieche ich noch immer Xylol, im zweiten Bad ist den Geruch vollständig verschwunden und so muss es sein, kein Xylol mehr nur reines Paraffin.

oder lässt du das Xylen einfach offen abdampfen?

Ich lasse das Gefäß verschlossen. Habe gelesen das beim öffnen Gasdruck abkommen kann aber habe es noch nie bemerkt.

das mischt sich gar nicht mit Isopropanol

Ich denke auch das das nicht geht. Das Intermedium (Xylol) ist gerade dafür um die Kupplung von Alkohol mit Paraffin zu bekommen. Probiert habe ich es auch nicht.
Wohl habe ich mal mit Rotihistol eingebettet aber nur ein mal weil es, bei mir jedenfalls, nicht genügend Funktioniert hat und das bemerkt sich beim Schneiden. Vielleicht aber sind im Forum anderen die bessere Erfahrungen und/oder Tipps haben.









Grüße Ronald.

[Sascha D. F.]

Hallo,

wenn ich die Alkohollösungen der aufsteigenden Reihe gerne mehrfach verwenden möchte um etwas Lösungsmittel zu sparen, komme ich an dem Punkt, wo ich bei mehreren Präparaten ja dann einige Tage hintereinander Paraffinblöcke gießen müsste.
In kann ich die in Paraffin überführten Proben  dann mit den Einbettkassetten aus dem Paraffin herausnehmen, also nach dem letzten Schritt und abkühlen lassen zum sammeln?
Und dann vor dem Eingießen in den block diese im Trockenschrank wieder auf Temperatur bringen?
Somit hätte ich die "Paraffin-Kleckerei" nur einmal.
Wenn ich so die professionellen Einbettstationen ansehe, haben die ja auch ein Fach wo bei ca 60 ° die Einbettkassetten  mit Präparat temperiert werden.
Hat da jemand Erfahrung?
Danke
Danny

[Muschelbluemchen]

Hallo

Ich habe bisher nur pflanz. Material geschnitten. Die Einwirkdauer der einzelnen Alkoholstufen war bei meinen Objekten fallsweise mehrere Tage, habe ich oft nicht so genau genommen.
Wichtig bei pflanz.Material ist es kein Xylol als Intermedium zu verwenden, pflanz. Material wird dadurch splitterhart und ist eigentlich nicht mehr zu schneiden.
Gute Erfahrung machte ich mit Terpineol http://de.wikipedia.org/wiki/Terpineole. Terpineol ist weniger wasserempfindlich als Xylol und Benzol.
Man kann die Objekte schon vom 90%Alkohol in ein Alkohol/Terpineol-Gemisch übertragen.
Bei Terpineol als Intermedium muss aber das Paraffin öfters gewechselt werden, da es schlechter Paraffin löst und es muss wieder komplett aus dem Material raus.
Reste von Terpineol produzieren schlecht schneidbare Objekte (die Schnitte schmieren!)
Nachlesen kannst du das hier gesagte bei: Botanische Mikrotechnik, Dieter Gerlach, Thieme Verlag - Seite 55 bei der 3 unveränderten Auflage.

mit freundlichen Mikrogrüßen
Leo