Warum Färbt mein Luxol Fast Blue nicht??

Ronald Schulte · August 14, 2012, 11:16:33 VORMITTAG

Ziel war: Luxol fast blue mit Cresylechtvioletazetat.

Ich habe ein Bouin Fixiertes Gehirnteil genommen (es sollte aber Formol Fixiert sein aber ja man hat nicht immer alles so auf den Regal liegen).
Habe 0,1 Gramm in 100ml Ethanol 95% gelöst und die Schnitte von aus 95% Ethanol 12 Stunden 60 Grad Gefärbt.
Heutemorgen fand ich die Farbe schon nur sehr Blassblau.
- Kurz Differenziert mit 0,01% Lithiumkarbonat
- Weiter Differenzieren mit 95% Ethanol
- Gegengefärbt mit Cresylechtvioletazetat
- 2x 100% und eindecken.

Habe es auch nur mit Luxol fast blue probiert (also ohne Cresyl) aber es färbt sich gar nicht.

Hat eine ein Idee was Falsch sein könnte? (Fixierung, Farbpulverbetrug aus England?)

Grüße Ronald

purkinje · August 14, 2012, 11:28:44 VORMITTAG

Hallo Ronald,

habe gerade meine alten Aufzeichnungen nicht hier; habe vor >10a mal diese Markscheidenfärbung ausprobiert:
falls ich mich recht entsinne war das LFB von Chroma und die Fixierung SEHR entscheidend, am besten aber nicht perfekt ging es bei mir (Gefrierschnitte, menschl Gehirn) nur bei längerer Formolfixierung (4% > 15 min) mit nachfolgender aufsteigender EtOH-Reihe (70,96,100%). Kritisch war auch der pH der LiCO3 Lösung, weiß gerade aber nicht mehr in welchem (alk) Bereich es am besten ging. Ein NEUROPATHOLOGE RIET MIR DAMALS AUCH ZU EINEM KURZEN ENTFETTUNGSSCHRITT VOR DER FÄRBUNG (ACETON).

BESTE GRÜßE
STEFAN

Ronald Schulte · August 14, 2012, 12:36:26 NACHMITTAGS

Stefan,

Gerne hätte ich da was mehr Daten von dich wenn das geht.
Ich könnte ja auch probemal was Schnitte in Wasser bringen und ein oder zwei Wochen in 4% Formol nachfixieren.
Auch bin ich interessiert an den PH von das Lithiumkarbonat (ich finde 0,01% so oder so nur sehr wenig!)

Vielleicht muss ich in mein nächstes Projekt mal ein Gehirn ausbauen und ein Hälfte Formol und die andere Hälfte Ethanol Fixieren.

Höre noch von dich, grüße Ronald

purkinje · August 14, 2012, 23:33:30 NACHMITTAGS

habe nachgesehen wir haben damals diese Protokoll verwendet;http://www.aeisner.de/methoden/farb67.html
also 0,05% !! LiCO3 , Schritt 11 "Bläuen" in Leitungswasser und LFB 0,1% (EtOH + 0,05% ESSIGSÄURE) !! erscheinen mir die wichtigsten Unterschiede zu deinem Protokoll zudem wird mit Hämatoxylin nach Harris gegengefärbt
Beste Grüße
Stefan

Ronald Schulte · August 15, 2012, 08:13:39 VORMITTAG

Stefan,

Danke. Ich werde mal weiter probieren mit das richtige fixativ und die Konzentration von das Lithiumkarbonat erhöhen. Wenn es gelingt mache ich ein Beitrag.

Grüße Ronald

purkinje · August 15, 2012, 12:32:13 NACHMITTAGS

Das sog "Bläuen" war auch sehr wichtig- es sollte in Leitungswasser erfolgen, vermutl spielen Na+ und Ca2+ Ionen hier eine Rolle; es verstärkte den Farbton deutlich, ein portugiesische Kollegin empfiehlt billiges stilles Mineralwasser hierzu!
Ich persönlich war kein Fan von Pikrinsäure-haltigen Fixativen, besonders in der Immunhistochemie lieferte das falsch positive Resultate und auch die Gegenfärbungen waren oft nicht sehr schön. Vielleicht hilft das "Spülen" der Schnitte in PBS vor der Färbung etwas.
Beste Grüße
Stefan

Klaus Henkel · August 15, 2012, 12:52:21 NACHMITTAGS

Zitat von: purkinje in August 15, 2012, 12:32:13 NACHMITTAGS
Das sog "Bläuen" war auch sehr wichtig- es sollte in Leitungswasser erfolgen, vermutl spielen Na+ und Ca2+ Ionen hier eine Rolle; es verstärkte den Farbton deutlich, ein portugiesische Kollegin empfiehlt billiges stilles Mineralwasser hierzu!
Stefan

Zum Bläuen siehe:
http://www.klaus-henkel.de/brunnenwasser.html

Gruß
KH

purkinje · August 15, 2012, 12:57:06 NACHMITTAGS

Hallo Herr Henkel,

sehr interessanter Hinweis! Es scheint also ein Frage des leicht alkalischen (gepufferten) pH Wertes zu sein- wieder etwas gelernt

Beste Grüße in die "Nachbarschaft"

Stefan

Ronald Schulte · August 15, 2012, 13:12:52 NACHMITTAGS

@Klaus und Stefan,

Klaus hat Gans recht. Nur in Alkalischen Wasser kann man Haematoxylin Blauen. Hier in Friesland (Niederlanden) ist das Leitungswasser schon so Hart (Kalkreich) das das Blauen sehr einfach geht.
Wenn nicht dann nehme ich in ein Becherglas ein Tropfen Ammoniak (Bauladen) und den PH steigt damit nach PH 8,0. Meine Erfahrung ein Prima Wert.
Die Rotgefärbte Schnitte (meist ist fünf Minuten genug für 4 um dicke Schnitte) spule ich zuerst schnell mit AD ab und setze sie dann in das Leitungswasser. Das ist wohl ein wichtige schritt weil sonst das Haematoxyline sich auf den OT festsetzen kann. Einfach schnell wegspulen mit AD ist die Antwort.

Grüße Ronald

Jürgen H. · August 17, 2012, 08:39:37 VORMITTAG

Hallo,

Ich könnte mir vorstellen, dass Herr Romeis vielleicht Brunnenwasser deshalb verlangt hat, weil im Leitungswasser Chlor ist. Seit der Trinkwasserverordnung 2001 ist der Chlorgehalt in Deutschland allerdings auf einen minimalen Wert als Obergrenze festgesetzt, so dass Chlor im Leitungswasser Deutschlands (und der EU) heute kaum stören dürfte. Wie die Obergrenzen davor aussahen, weiß ich nicht. Prinzipiell könnte jedenfalls übermäßiges Chlor die Färbung stören.

Schöne Grüße

Jürgen

reblaus · August 17, 2012, 08:48:34 VORMITTAG

Hallo Jürgen -

dumme Frage: Den Ausdruck "Brunnenwasser" bei Romeis et. al. hatte ich bisher einfach als veraltetes Synonym für Leitungswasser interpretiert. Ist das nicht der Fall?

Gruß

Rolf

Jürgen H. · August 17, 2012, 10:35:31 VORMITTAG

Hallo Rolf,

so schreibt es ja auch Klaus Henkel. Brunnenwasser sei mitunter sogar kontraproduktiv, da es oftmals sauer sei. Vielmehr sei mit Brunnenwasser Leitungswasser gemeint, ein spezifisch bayrischer Ausdruck, wenn ich recht verstehe. Nun hat ja Herr Romeis, auch wenn er Münchner war, nicht nur für Bayern geschrieben und daher habe ich eine andere Interpretationsmöglichkeit in Erwägung gezogen: abgestandenes und daher chlorarmes Wasser aus einem Brunnen sprich dem von Herrn Henkel angesprochenen Waschtrog. Aber ich werde wohl falsch liegen....

Schöne Grüße
Jürgen