Schnittprobleme am Schlittenmikrotom bei härteren Pflanzenteilen

[Michael W.]

Hallo Freunde dünner Pflanzenscheibchen,

bei bestimmten botanischen Objekten plagen mich beim Schneiden mit dem Schlittenmikrotom bestimmte Probleme.

Kurz zur Technik allgemein: Ich schneide am Schlittenmikrotom stets mit Einmalklingen und ,,ziehender Klinge" (also möglichst über die ganze Klingenlänge). Geschnitten wird stets unter Zusatz von reichlich 70%igem Ethanol. Die übliche Schnittdicke liegt bei mir bei 20-30µm.
Bei einer Vielzahl von Objekten gibt es überhaupt keine Problem, da gelingt nahezu jeder Schnitt. In erster Linie sind das mittelfeste, noch nicht verholzte Stücke von Stengel, Spross, Trieb, etc. Weicheres, dünneres Material wird in Holundermark eingeschlossen und samt Holundermark geschnitten. Bei mittelfesten Objekten wird das Objekt nur in Styrodur eingeklemmt und nur der Teil geschnitten, der aus dem Styrodur herausschaut. Nun zu verschiedenen "Problemfällen", die mir in letzter Zeit immer wieder untergekommen sind.

1.) Festeres (aber nicht stark verholztes, also noch etwas elastisches) Material (Durchmesser etwa 3-5mm) einspannen, das keinen asymmetrischen Druck verträgt
Festere Objekte brauchen eine gute Einspannung/Fixierung, damit sie beim Schneiden der Klinge nicht ausweichen können. Manche Objekte mögen es aber überhaupt nicht, wenn sie zwischen 2 Styrodurklötzen (oder auch zwischen 2 Metallbacken) geklemmt werden. Durch das unsymmetrische Spannen "bricht" nämlich an einer Seite meistens ein Teil der äußeren Schicht (ähnlich einer Rinde) plattenweise ab, selbst wenn die Schnittfläche mehrere Millimeter von der Klemmstelle entfernt ist. Diese "Bruchstelle" führt dann dazu, dass bei jedem Schnitt an derselben Stelle der äußere Teil fehlt und damit der Schnitt Ausschuss ist. Selbst wenn man beidseitig in die Styrodurklötzchen eine Nut schneidet, gibt es diese Probleme.

Welche Vorgehensweise kann man bei solchen Materialien empfehlen?
Komplett freistehend (z.B. in eine wenige mm tiefe Bohrung mit Sekundenkleber eingeklebt) eignet sich hier nicht, da die von mir gemeinten Pflanzenteile dafür noch zu biegsam sind – also dem Messer ausweichen könnten.

2.) Verholztes, dünneres Material (Durchmesser max. ca. 3mm) einspannen
Verholzte dünne Zweige sind für direktes Einspannen oft nicht so geeignet, weil sie vom Messer unter Umständen trotzdem noch weggedrückt werden könnten. Man könnte höchstens so spannen, dass das zu schneidende Objekt nur noch 1-2mm heraussteht. Das tue ich aber nicht so gerne, weil man bei jedem Schnitt höllisch aufpassen muss, dass man sich die Klinge nicht an der Spannvorrichtung ruiniert.

Wie spannt ihr solches Material?

3.) Härteres, etwas verholztes Material weicher machen
Dazu wurden ja schon zahlreiche Methoden erwähnt: AFE-Gemisch mit erhöhtem Essigsäureanteil, AGE-Gemisch (also mit Glyzerin statt Formalinlösung), Kochen in Essigsäure, Kochen in Wasser, Wasserdampf, etc.
Leider steht bei vielen Tipps nicht dabei, wie hart die Probe vor dem erweichen wirklich war. Es macht ja schon einen großen Unterschied, ob das Objekt einfach nur ein bisschen zu hart ist, um es einfach so zu schneiden (weil z.B. nur eine dünne "Rinde" vorhanden ist) oder ob es sich um einen massiven Zweig von einer Buche handelt. Außerdem schwankt bei den Gemischen mit Glyzerin die Glyzerinmenge erheblich – von 5% bis 60% habe ich gelesen.
Da ich kein Freund davon bin, zahlreiche unterschiedliche Gemische mit jeweils verschiedenen Konzentrationen an verschiedenen Objekten zu vergleichen, habe ich in der Vergangenheit immer nach Bauchgefühl gehandelt. Leider hat mich das Bauchgefühl da schon öfters getäuscht und dann war's wieder nichts mit schönen Schnitten.

Kann mir jemand Empfehlungen geben, wie ihr leicht, mittel und stark verholztes Material jeweils behandeln würdet? Oder bleibt einem nichts anderes übrig, als bei jeder neuen Probe in mehreren Test eine geeignete Methode zu finden?

Schon mal vorab vielen Dank für eure Hilfe!

Viele Grüße
Michael

PS: Vielleicht kann mir ja noch jemand eine Frage beantworten, die mir gerade noch eingefallen ist: beschäftigt sich das Buch "Wood Microtomy" von Ernie Ives auch mit solchen Problemstellungen (also nicht nur von massivem Holz)? Wenn ja, wäre das ja ein Grund dafür es in England zu bestellen.

[bbb]

Hallo,
also ich würde vorschlagen du Fixierst dein Material mal mit AGG-Gemisch (Alkohol-Glycerin-Glutaraldehyd):

Ethanol 96%ig           40,00   ml
Glycerin                   40,00   ml
Aqua dest.                   10,00   ml
Glutaraldehyd 25%ig   10,00   ml

Über 24 Stunden Fixieren (länger schadet nicht).
Dadurch lassen sich harte Pflanzen besser schneiden.
Falls kein Zugang zu Glutaraldehyd möglich ist durch Formol (37%ig Formaldehyd) ersetzen (geht nicht so gut aber klappt auch).
danach in 70% Ethanol auswaschen und normal Einbetten und Schneiden oder direkt aus 70% Ethanol schneiden.

Ich hoffe ich konnte helfen!

liebe Grüße
Max Bergmann

[Fahrenheit]

Lieber Michael,

was Deinen Punkt 3 angeht, hat Max recht, ich kenne die Mischung mit Formaldehyd und das funktioniert gut. Wenn es mit Glutaraldehyd noch besser geht: das muss ich mal probieren, danke, Max.

Selbst schneide ich ja in den aller meisten Fällen auf dem Handzylindermikrotom und kann somit die Schnittführung variabel steuern (Schneidewinkel, Geschwindigkeit, druck ...). Da bei schneide ich eigentlich alles ab einer Dicke von rund 3 mm freistehend direkt in die Metallbacken des Mikrotoms eingeklemmt.
Mit dem Schlittenmikrotom habe ich kaum Erfahrung aber Du könntest unterschiedliche Schneidegeschwindigkeiten probieren (manchmal hilft auch ein schnellerer Schnitt ...) und ggf. den Anstellwinkel der Klinge noch etwas verringern.
Wenn Du Holundermark verwendest, darfst Du nicht mit Ethanol befeuchten. Dadurch verliert das Mark seine Stabilität (es weicht auf) und somit auch seine Funktion. Ersatzweise kannst Du in Möhre einbetten. Die ist härter und passt somit besser zu leicht verholzten Proben - außerdem kannst Du wie gewohnt mit Ethanol arbeiten.

Herzliche Grüße
Jörg

[Michael W.]

Hallo Max,

also ich würde vorschlagen du Fixierst dein Material mal mit AGG-Gemisch (Alkohol-Glycerin-Glutaraldehyd):

danke für diese Empfehlung. Ich habe dieses Rezept schon mal auf der Homepage von Armin Eisner entdeckt, aber wegen dem nicht ganz so leicht beschaffbaren Glutaraldehyd ist die Rezeptur schnell wieder ins Vergessen geraten. Aber wenn man das Glutaraldehyd zur Not auch mit Formalinlösung ersetzen kann, werde ich mir mal was davon ansetzen.

Lieber Jörg,

danke für deine Antwort. Mit verschiedenen Schnittgeschwindigkeiten und Anstellwinkeln habe ich auch schon experimentiert. Bei etwas störrischen Objekten kann man damit durchaus eine Verbesserung erzielen.
Stimmt, Ethanol macht das Holundermark ganz schön weich, es wirkt ja wie ein Schwamm. Aber da ich es nur für ganz feines, weiches Material (z.B. Blattstengel) verwende, hat sich dieses Aufweichen bislang noch nicht negativ bemerkbar gemacht. Fast immer klemme ich in Styrodur ein und schneide freistehend (auch um die Klinge zu schonen).

Mein Verhältnis zur Möhre in der Mikrotomie ist gespalten. Für den freihstehden Schnitt finde ich sie nicht schlecht, da es festere Objekte stabiler hält als Styrodur. Für den Schnitt mit Möhre (also ganz eingebettet) verwende ich die Möhre nur ungeren. Ich hatte nämlich schon mehrfach winzige Karottenteilchen mit ins endgültige Präparat verschleppt, obwohl ich stets alles gründlich und mehrfach auswasche. Gerade bei der Wacker-Färbung wäscht man ja auch zwischendurch mehrfach aus, eigentlich dürfte da nichts mehr durchkommen. Auch habe ich im polarisierten Licht schon Kristalle am Schnitt haften sehen, die bei anderer Einbettung nicht vorhanden waren. Vermutlich waren das diese Carotinkristalle (?). Zwar hält sich der dadurch verursachte Ausschuss in Grenzen, trotzdem schalte ich potentielle Fehlerquellen immer lieber von vorn herein aus, bevor ich mich hinterher ärgere.

Viele Grüße
Michael