Probleme beim Einbetten

Winfried Todt · Oktober 30, 2013, 22:26:51 NACHMITTAGS

Verehrtes Forum,

meine Pflanzenschnitte färbe ich mit Etzold-grün {nach Brügmann}, gemäß der Anleitung des MBK: http://www.mikroskopie-bonn.de/_downloads/Faerbeanleitung_Etzold_gruen_100624.pdf .
Die Schnitte hat es mir immer bei der letzten Alkoholstufe zerrissen, so dass ich erst mit ca. 50%igem Isopropylalkohol mit der Entwässerung begonnen habe und danach mit 100%igem Isopropylalkohol weiter mache. Nur noch wenige Schnitte zerreißt es. Jetzt habe ich ein neues Problem, das ich Euch am Beispiel eines frisch eingedeckten Schnittes zeigen möchte:
Objekt: Stängel-Querschnitt der Dipladenia {Trichterblüte}, Schnittdicke: ca. 30µm, Färbung: Etzold-grün, Eindeckmittel: Euparal

Das Foto ist ca. 30 Minuten nach dem Eindecken gemacht worden, daher ist es ein bisschen flau (liegt am Euparal, gibt sich aber nach ein paar Tagen wieder).
Jetzt zerreißt es mir den Schnitt im Euparal.
Hat jemand von Euch dafür eine Erklärung? Gibt es einen ein Fehler im Prozessablauf?
Ich bin sehr an Eurer Meinung interessiert.

Herzliche Grüße
Winfried

Jürgen Ibs · Oktober 31, 2013, 07:40:00 VORMITTAG

Hallo Winfried,

ein ähnliches Problem brachte mich beinahe einmal zur Verzweiflung.

Die Schnitte kringelten sich und zerrissen, sobald sie mit Euparal in Berührung kamen. Eine aufsteigende Alkoholreihe half nichts, ich war ratlos, bis ich entdeckte, dass es am Euparal lag. Ich vermute, dass es schlicht zu alt war, nämlich schon 9 Jahre. Frisches Euparal hat diese Wirkung nicht. Warum das so ist, wissen nur die Chemiker. Vielleicht ist dein Euparal ja auch zu alt.
Zwischenzeitlich habe ich dann andere Mittel benutzt.

Grüße

Jürgen

liftboy · Oktober 31, 2013, 08:04:13 VORMITTAG

Hallo Winfried,

ich hab da ein ähnliches Problem mit Euparal.
Obwohl mit 100% total entwässert, bilden sich Bläschen im gesamten Euparal, die auch durch erwärmen nicht wegzukriegen sind.
Interessanterweise zeigt reines Euparal diesen Effekt nicht.
Ich bin jetzt dazu übergegangen, über Xylol entweder in Malinol oder Eukitt einzubetten. Hier tritt der Effekt nicht mehr auf.

Viele Grüße
Wolfgang

Fahrenheit · Oktober 31, 2013, 08:33:41 VORMITTAG

Lieber Winfried,

Gott sei Dank kenne ich keines der von Dir geschilderten Probleme mit der Euparaleindeckung über Isopropanol. Daher auch danke an Jürgen für den Hinweis, dass das Harz offenbar altert.

Mit der Zeit verdunstet aber auch das Isopropanol aus dem Gemisch und dass schon bei wenigen Monaten im Schliffglas. Das ergänze ich dann wieder, um die ursprüngliche Konsistenz zu erhalten. Eventuell ist auch das ein Ursache für die Risse: enthält das Harz zu wenig Isopropanol, könnte es sein, dass es beim Konzentrationsausgleich unter dem Deckglas zu Rissen im Schnitt kommt.

Nach meiner persönlichen Erfahrung ist der Übergang aus Wasser in reines Isopropanol unkritisch. Da hatte ich bei vielen hundert Präparaten noch nie ein Problem. Nur wenn ich ein wenig differenzieren muss, lasse ich beim ersten "Guss" noch etwas Wasser auf den Schnitten.

Herzliche Grüße
Jörg

JoachimHLD · Oktober 31, 2013, 09:52:56 VORMITTAG

Hallo zusammen,

auch ich habe hin und wieder das Problem, es gibt Material das starke Spannung bekommt beim Entwässern und reist oder sich verzieht:-(
Da ich das Problem besonders bei der Mistel habe hatte ich einen Versuch mit wasserlöslichem Einschlussmittel von B. Heim gemacht dies schrumpft aber so stark
das sich das Deckglas zu einer Beule über dem Schnitt verzieht. Bin dann bei Glyzeringelatine gelandet.
Euparal verdünne ich wenn es zu dickflüssig wird mit der von Waldeck erhältlichen Euparal-Essenz, die riecht wie Euparal, ich habe Schnitte auch schon mal
nach der "Schockentwässerung" darin für 5 Minuten eingelegt was aber am verziehen nicht geholfen hat.
Ich werde weiter nach einem brauchbaren wasserlöslichem Eindeckmittel suchen das sich an sonst wie Euparal verhält.

Viele Grüsse
Joachim

Peter Reil · Oktober 31, 2013, 13:46:13 NACHMITTAGS

Hallo,

bei meinen Pilzpräparaten mit Euparal hatte ich (Gottseidank) nie derartige Probleme.

Als wasserlösliche Eindeckmittel kann ich Hydromatrix (ich weiß, was das kostet...) und auch Glyceringelatine empfehlen.

Freundliche Grüße
Peter R.

liftboy · Oktober 31, 2013, 17:53:48 NACHMITTAGS

Hallo erstmal,

wenns denn wasserlöslich sein muss nehme ich Magnacol (Polyvenylchlorid-Basierend).
Bei Sporen hats immer hingehauen.

Grüße
Wolfgang

Winfried Todt · Oktober 31, 2013, 18:23:29 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen,
mein Euparal habe ich vor ca. zwei Jahren gekauft, an dem Alter kann es da wohl nicht liegen.

Hallo Wolfgang,
bei mir bilden sich kurz nach dem Eindecken mikroskopisch kleine Bläschen, die das Präparat mit einem Schleier einhüllen. Nach ca. 1-2 Wochen verschwinden sie dann meistens vollständig. Ich habe die Präparate auch schon direkt nach dem Eindecken für ca. 1 Stunde im Exsikkator unter Vakuum gesetzt, aber die mikroskopischen Bläschen sind trotzdem entstanden.

Hallo Jörg,
mein Isopropanol kaufe ich immer im 2,5l Gebinde (99,9%ig), und das ist ein Kunststoffbehälter, dann fülle ich es für den Gebrauch in eine 25ml Pipettenflasche. Ich vermute hier keinen nennenswerten Konzentrationsverlust durch Verdunstung.

Hallo Joachim,
bitte berichte mir (uns) wenn Du ein brauchbares Mittel gefunden hast.

Hallo Peter,
danke für den Hinweis auf das Hydro-Matrix, das scheint ja für Schulen geeignet zu sein.

Danke an Euch alle,
mein Résumé aus Euren Hinweisen ergibt sich wie folgt:
- zwei von Euch haben ähnliche Probleme wie ich,
- einer hat hin und wieder Probleme,
- zwei von Euch haben diese Probleme bisher nicht gehabt,
hieraus folgere ich, dass mein Prozess noch nicht ausgereift bzw. noch fehlerhaft ist.
Ferner gehe ich davon aus, dass zumindest Jörg, bei seinen unzähligen Schnibbeleien, über eine hinreichende Erfahrung verfügt, um beurteilen zu können ob Euparal die beschriebenen Probleme bereitet.
Die einzige unbekannte Größe, die ich momentan ausmachen kann ist das wirkliche Alter meines Euparals. Auf der 100g Flasche der Firma ROTH ist nur die Nr. der Charge angegeben, ein Datum fehlt.

Herzliche Grüße
Winfried

Fahrenheit · Oktober 31, 2013, 19:39:19 NACHMITTAGS

Lieber Winfried,

ich glaube, wir haben da ein kleines Missverständnis: das Intermedium und Lösungsmittel für Euparal ist Isopropanol. Wenn Euparal in nicht 100%tig dicht schließenden Gefäßen aufbewahrt wird, verdunstet das Isopropanol. Langsam, aber sicher. ;-)
Da fülle ich halt immer etwas nach und rühre vorsichtig um. Da ich das Problem selbst nicht kenne, habe ich vermutet, dass vielleicht ein zu "zähes" Euparal, also eines mit zu wenig Isopropanol, zu den von Dir beobachteten Rissen in den Schnitten führen könnte.

Herzliche Grüße
Jörg

Winfried Todt · Oktober 31, 2013, 20:07:00 NACHMITTAGS

Hallo Jörg,

was sage ich da zu mir, wer lesen kann ist klar im Vorteil. Danke für die Aufklärung, ist mir einfach durch die Lappen gegangen.
Meine Argumentation sollte aber sonst schon schlüssig sein?

Herzliche Grüße
Winfried

JoachimHLD · Oktober 31, 2013, 21:50:35 NACHMITTAGS

Hallo Jörg,

bei mir tritt außer bei der Mistel das Problem auf wenn sich der Schnitt beim Entwässern verzieht durch verschiedene Schrumpfung
der unterschiedlichen Zellarten und dann der Druck des Deckglases beim Beschweren den Schnitt platt drückt.
Irgendwann reist dann der Zellverband. Passiert selten, dann weiche ich auf die Glyzeringelatine aus wobei
mir da in der Vergangenheit die Färbungen verblichen sind.

Hallo Winfried, "Includal PVP" war nicht die Lösung :-(

Herzliche Grüsse
Joachim

Fahrenheit · Oktober 31, 2013, 22:02:09 NACHMITTAGS

Lieber Joachim,

ich gestehe: das Problem kenne ich nicht.

Mistel habe ich auch hier, die Präparate sind 3 Jahre alt und völlig in Ordnung. Eines haben wir noch nicht bedacht: ich schneide mit 50 µm relativ dick. Da ist das Material auch stabiler. Ob das den Ausschlag gibt?

Lieber Winfried,

ganz sicher bin ich mir nicht, aber ich würde beim Euparal anfangen. Aus meiner Sicht ist das Entwässern unkritisch - siehe oben.

Euch beiden herzliche Grüße
Jörg

RainerTeubner · Oktober 31, 2013, 23:38:26 NACHMITTAGS

Hallo Winfried,

Deine Beobachtung

Hallo Wolfgang,
bei mir bilden sich kurz nach dem Eindecken mikroskopisch kleine Bläschen, die das Präparat mit einem Schleier einhüllen. Nach ca. 1-2 Wochen verschwinden sie dann meistens vollständig. Ich habe die Präparate auch schon direkt nach dem Eindecken für ca. 1 Stunde im Exsikkator unter Vakuum gesetzt, aber die mikroskopischen Bläschen sind trotzdem entstanden.

spricht meiner Meinung nach dafür, daß der Schnitt noch nicht vollständig entwässert gewesen sein könnte, mit zuviel Wasser trübt sich Euparal.

Mit der Zeit verdunstet das Wasser und die Tübung verschwindet.

Viele Grüße

Rainer

Rawfoto · Oktober 31, 2013, 23:42:57 NACHMITTAGS

Hallo Joerg

Wenn ich richtig informiert bin schneidest Du deutich dicker, ich gehe nach der Faerbung bei "duennen" Schnitten zuerst kurz in 30%igen Alkohol um die Risse zu verhindern ...

Dabei wird sofort wieder abgesaugt sobald der 30%ige eingefuellt ist, sonst zieht zu viel Farbe aus! Dann geht es ab in den ISO (unverduennt) ...

Bei den 50er Schnitten brauche ich den Zwischenschritt nicht, wende ihn aber der Differenzierung willen dort jetzt auch an ...

Liebe Gruesse

Gerhard

Fahrenheit · November 01, 2013, 07:22:38 VORMITTAG

Lieber Rainer,

oh, das habe ich überlesen. Aber da hast Du recht: das wird Wasser sein.

Man kann die Blasen übrigens unterscheiden. Mir ist das auch ein mal passiert, als ich einen Schnitt mit dem falschen, wasserfeuchten Pinsel übertragen und eingedeckt habe. Da haben sich sofort Wassertröpfchen abgeschieden und es war auch eine kleine Luftblase mit drin: Luft hat einen geringeren Brechungsindex und die Luftblasen haben daher einen markanteren dunklen Rand. Außerdem verschwinden kleine Luftblasen im Euparal schon in den ersten 5 Minuten - man kann also zuschauen - und sie "schweben" frei im Euparal oder dem Zellverband der Probe. Das Wasser lagert auf dem OT oder der Probe und bleibt deutlich länger erhalten.

Mein seinerzeit "klatschnasser" Schnitt war nach gut 6 Monaten wasserfrei - allerdings auch weitestgehend entfärbt.

Lieber Gerhard,

ja, die 50 µm Schnitte sind so robust, die überstehen das Entwässern klaglos.

Demnächst bekomme ich wieder dünnere Längsschnitte von Bodo. Ich werde dann einmal explizit darauf achten, wie die sich beim Entwässern und Eindecken verhalten.

Herzliche Grüße
Jörg