Botanik: Testfärbung mit Brilliantkresylblau an Pflanzenschnitten

[Jan Kros]

Lieber Jorg,
Ich möchte mich noch bedanken für deinen Auskunft über das Stäcken.
Herzlichen Gruss
Jan

[Fahrenheit]

Hallo liebe Färberzunft!

Heute Abend habe ich das nun 5 Tage alte Dauerpräparat der mit Briliantkresylblau (BKB) gefärbten Ginkgoschnitte noch einmal geprüft und photografiert.

Am 12. habe ich ja schon die Vermutung geäußert, dass das BKB, zumindest in meiner Präparation, nicht stabil ist und dies hat sich heute eindrucksvoll bestätigt. Zum Vergleich zum Bild 2 aus meinem Eingangsposting hier nun die neuen Bilder eines der 90 Minuten lang gefärbten Schnitte.

Bild 7: Die Erste Aufnahme, wieder bei 200x als Stapel von 14 Bildern


Bild 8: Der gleiche Bildausschnitt 3 Stunden später (nur die Kamera ist etwas verrutscht), nun ein Stapel von 7 Bildern, die auch ausreichen, um die nötige Schärfe zu erreichen.


Schon das erste Bild ist deutlich blasser als der frisch gefärbte Schnitt im alten Bild 2. Nach drei Stunden unter der leicht abgedimmten Mikroskopbeleuchtung (20 Watt, Halogen, korrekt geköhlert) jedoch ist der Farbstoff nocheinmal eklatant weiter verblasst.

Das Testpräparat enthält 2 Schnitte, der zweite war während der Untersuchung aufgrund der zugezogenen Leuchtfeldblende nicht beleuchtet und zeigt deutlich kräftigere Farben. Dies unterstützt meine These, das das BKB nicht lichtecht ist.

Aus meiner Sicht ist das das Ende der Karriere des BKB als Farbstoff für Dauerpräparate - oder ich habe einen groben Fehler in meinem Rezept.
Allerdings findet sich im Netz sowohl ein Hinweis auf die Lichtempfindlichkeit des Farbstoffsalzes als auch immer wieder die Beschreibung als In-vitro-Farbstoff. Das wird wohl seine Gründe haben.

Klaus, kannst Du bitte noch mal einen kritischen Blick auf Dein altes Dauerpräparat mit der BKB-Färbung werfen? Wie ist es gelagert und hat es noch die gleiche Brillianz wie das Moosblättchen, das Du in der letzten Woche gefärbt hattest?
Wenn die Färbung bei Dir nicht gelitten hat: wie hast Du genau gefärbt?

Herzlichen Dank!
Jörg

[Klaus Herrmann]

Lieber Jörg,

jetzt habe ich meinen inneren Schweinehund überwunden, und statt die Reste des Zwetschgenkuchens zu essen die ollen Präparate rausgeholt:

In dieser Kiste sind sie versammelt und sehen aus wie auf den nächsten Bildern ! Ich habe nachgeschaut, das Biopraktikum im Gymnasium war 2005!
Also 4 Jahre her!

Und das nimmst Du zurück: die Klage vor der Menschenrechtskommission ist schon eingereicht!:

Aus meiner Sicht ist das das Ende der Karriere des BKB als Farbstoff für Dauerpräparate

Kannst Du noch abwenden, wenn Du einen Kurs bei mir belegst:

die Verwendung des genialen BKB als unkomplizierten Farbstoff für botanische Dauerpräparate







Die Epidermisabzüge lagen aus Zeitgründen nur kurz in 70%igem Ethanol, dann wurde gefärbt, ausgewaschen und über Isoprop in Euparal eingedeckt.

Ich habe sie immer im Kasten und der ist im Schrank. Also intensive Sonne haben die Präparate wie alle meine Präparate natürlich nicht ab bekommen!

[Fahrenheit]

Lieber Klaus,

vielen Dank für Deinen Verzicht auf den leckeren Zwetschgenkuchen, über den sich bestimmt Deine Familie her gemacht hat, als Du treu sorgend in Deiner Präparatekiste gewühlt hast. 

Man sieht es schon beim Blick in die Kiste: alles Brilliantkresylblau (bis auf wenige Ausnahmen mit anderer Färbung ...).

Sehr seltsam. Meine Präparate haben 48 Stunden in AFE zugebracht, dann 60 Stunden in Ethanol 70%. Nach dem Schneiden ging es wieder ins Ethanol.
Nach ca. 10 Tagen habe ich mit  3 Wechseln gewässert und dann mit einer Lösung von ca. 0,025% BKM für 90 Minuten gefärbt. Die Ergebnisse sahen alle so aus wie in Bild 2 hier im Eingangsposting.

Anschließend habe ich mit 3 Wechseln (30 Sekunden und zwei mal drei Minuten) in Isopropanol überführt und dann in Euparal eingeschlossen.

Die Präparate waren da schon gefühlt etwas bleicher, da sie eine ausgiebige Photosession hinter sich hatten und auch einige Zeit im Licht der Halogenlampe auf dem Objekttisch lagen.

Was nun passiert ist - nach 4 Tagen in einem recht dunklen Kellerraum, ohne direktes Licht und mit einem Mutternstapel als Gewicht abgedeckt, zeigt am besten Bild 7. Nach drei weiteren Stunden auf dem Objekttisch war ich dann bei Bild 8.

Denn Prozess gewinne ich! Besonders da der zweite unbelichtete Schnitt unter dem selben Deckglas (!) sogar noch etwas kräftigere Farben zeigt als Bild 7.

Ich weiss, ich verlange viel, aber da Du ja recht viele Präparate hast: könntest Du Dir vorstellen, eines davon unter gleichen Bedingungen wie bei mir auf dem Objektträger zu belichten? Wenn Du zum Beispiel bei 200x nach Köhler ausleuchtest und das BKB wirklich lichtempfindlich ist, solltest Du einen ausgebleichten "Fleck" an der belichteten Stelle erhalten ...
Dann hätten wir eine gesicherte Aussage, wie sich der Farbstoff in eingeschlossenen Zustand verhält.

Ich werde zunächst einmal versuchen, wie sich das BKB auf Filterpapier verhält. Wenn der Farbstoff getrocknet ist, werde ich eine Probe halb abgedeckt auf die Fensterbank legen und hier berichten. Dann haben wir zwar kein Verhalten unter Luftabschluss, aber immerhin.

Herzliche Grüße
Jörg

[Fahrenheit]

Hallo liebe Färberzunft,

hier nun die Ergebnisse meines Belichtungstests mit BKB (Brilliantkresylblau).

Bild 9: Ein mit einer 2,5%igen BKB-Lösung getränkter Filterpapierstreifen nach dem Trocknen am 16.09. ...


Bild 10: Wird bis zum 19.09. halb verdeckt für ca. 8 Stunden dem direkten Sonnenlicht und weiteren 4 Stunden einer Halogenleuchte (20 Watt, 5 cm Abstand) ausgesetzt:


Bild 11: Es ist nur eine ganz leichte Ausbleichung zu erkennen:


Bild 12: Zur Verdeutlichung mit Trennlinie zwischen dem abgedeckten und dem offenen Teil:


Bild 13: und nochmal näher ran:


Somit können mangelnde Lichtechtheit und Wärme nicht alleine für das bei meinen Präparaten beobachtete Ausbleichen verantwortlich sein. Und ich bin ziemlich ratlos.

Zur Zeit trocknen 4 weitere mit BKB gefärbte Präparate (Querschnitte durch einen Blütenstiel einer Orchideenhybriden - Phalaenopsis spec.), je zwei in altem und frischem Euparal. Die Ergebnisse werde ich wieder hier zeigen.

Wer Ideen hat, woran das Ausbleichen liegen könnte oder mittlerweile eigene Erfahrungen mit dem BKB: ich bin für jeden Hinweis dankbar.

Herzliche Grüße
Jörg

[Horst Isele]

Hallo Jörg

Wenn ich alle Deine Beiträge hier analysiere, dann ist Dein Bleichversuch noch nicht ganz korrekt durchgeführt worden.

Du solltest noch einen halben Farbstreifen mit Isopropanol behandeln und dann beide Streifen mit Euparal bestreichen. Trocknen lassen und nochmals an die Sonne damit.
Erst dann kannst Du genaueres über die Lichtechtheit der Färbung aussagen.

Ich hoffe, dass ich Dir damit nicht zu viel Arbeit aufhalse.   

Gruss  Horst

[Fahrenheit]

Hallo Horst,

vielen Dank für Deinen Hinweis und nein, das tust Du nicht 

Diese Tests mache ich an den kompletten Präparaten. So habe ich den gesammten Präparationsverlauf mit erfasst. 
Zwei - je eins mit dem alten und dem frischen Euparal - gehen Morgen in die Sonne.

Herzliche Grüße
Jörg

[Fahrenheit]

Nachgelegt:

hier schon mal zwei Bilder als Ausgangspunkt für die nächste Testreihe - Präparation und Technik wie im Eingangsposting beschrieben.

Bild 14: Leitbündel aus dem Blütenstiel einer Orchideenhybriden (Phalaenopsis spec.), Vergrößerung 400x, Stack aus 3 Einzelbildern.


Bild 15: Cuticula aus dem Blütenstiel einer Orchideenhybriden (Phalaenopsis spec.), Vergrößerung 400x, Stack aus 10 Einzelbildern.


Zur Vergleichbarkeit: alle Schnitte entstammen der selben Schnittserie, wurden gemeinsam gelagert (Ethanol 70%) und gleichzeitig in den selben Reagenzien präpariert. Einziger Unterschied ist das verwendete Euparal (zwei 'alt', zwei 'neu').

Auffällig bei dem Leitbündel: die Färbung des Phloems geht ins Violette. Diese Farbe nimmt das BKB an, wenn es mit Klorix in Kontakt kommt - wird also nicht farblos.

Herzliche Grüße
Jörg

[Eckhard]

Hallo Jörg,

das sieht doch sehr sehr schön aus - Schnitt, Färbung und Bild. Und das BKB bekommst Du sicherlich auch in Griff.

Herzliche Grüsse
Eckhard

[Fahrenheit]

Guten Morgen Eckhard,

danke für die Aufmunterung!  Das Lob für die Schnitte geht allerdings an Rolf-Dieter, sie stammen aus einem Färbe-Workshop in Bonn.

Wart' mal ab, wir wollen ja noch versuchen, eine Gegenfärbung mit Nelkenöl und Eosin einzufügen.

Dazu muss das BKB in meinen Präparaten aber erst mal einigermaßen stabil bleiben.

Schöne Grüße
Jörg

[Fahrenheit]

Guten Abend liebe Färberzunft,

nach dem sich die Sonne die letzten Tage bei uns etwas rar gemacht hat, hier nun die Ergebnisse meiner Versuche zur Lichtechtheit des Brilliantkresylblaus (BKB).

Dazu hatte ich 4 Präparate von Querschnitten des Blütenstängels einer Orchideenhybriden angefertigt und zwei davon in den letzten Tagen für insgesamt ca. 8 Stunden dem direkten Sonnenlicht ausgesetzt. 4 Präparate, weil ich älteres und frisches Euparal verwendet habe - die Ergebnisse zeigen jedoch diesbezüglich keine relevanten Unterschiede.

Das Belichten sah etwa so aus:
Bild 16: Belichtung von zwei der vier Testpräparate, die anderen beiden bleiben zur Dokumentation im Dunkeln:


Technik und Präparation wie eingangs beschrieben. Im Gegensatz zu den schon geposteten Referenzbildern hier nun die Bilder der dem Sonnenlicht ausgesetzten Präparate bei nur zweihunderfacher Vergrößerung, in Stapeln von 3 bzw. 11 Bildern. Die beiden Referenzpräparat sind zur Dokumentation im Dunkeln geblieben.

Die Schwächen der Bilddarstellung und Bearbeitung sowie das fehlende Equipment erlauben mir keine quantitativen Aussagen - es zählt also der qualitative Überblick (jeweils unbelichtet gegen belichtet direkt untereinander):

Bild 14 und 17: Das Leitbündel:




Bild 15 und 18: die Cuticula:



Wie man sieht, ist neben kleineren Veränderungen (durch den Lichteinfluss aber vor allem durch die für mich nicht genau reproduzierbaren Verhältnisse bei der Bildgewinnung und -darstellung) kein nennenswertes Nachlassen der Farbbrillianz feststellbar.

Lieber Klaus: Du hattest also Recht mit Deinen Aussagen zur Stabilität des BKB - aber selber experimentieren macht schlau! 

Was hat aber nun zum Ausbleichen der Ginkgo-Schnitte geführt, die nach dem gleichen Verfahren präpariert worden sind?

Zum einen besteht eine geringe Wahrscheinlichkeit, dass es mit dem Material selbst, also dem Ginkgo zu tun hat. Ich glaube das nicht.

Viel eher denke ich, dass die Umstände der Präparation eine Rolle gespielt haben. Eigentlich ging es mir eingangs nur darum, zu probieren, wie sich der für mich neue Farbstoff BKB auf Pflanzenschnitten verhält. Da er die Hyalinzellen der Toorfmoose so schön anfärbt, vermutete ich, dass er auch recht spezifisch auf sklerifizierte Gewebe höherer Pflanzen aufzieht - was sich ja auch bestätigt hat.
Die Schnitte waren jedoch so attraktiv und zeigten bestimmte Details deutlicher als z.B. Material in Etzold (vergleiche Bilder 3 bis 6), dass ich am Ende einer gut zweistündigen Session dann doch Dauerpräparate erstellen wollte.
Ich gehe heute davon aus, dass die Schnitte in dieser Zeit gelitten haben und ich am Ende nicht gut genug entwässert habe.
Meines Wissens nach sind insbesondere Farbstoffe, die aufgrund elektrostatischer Effekte am zu färbenden Substrat anlagern, empfindlich gegen Restfeuchtigkeit. Hier vermute ich die Lösung für die beobachtete Ausbleichung.

Was nun noch fehlt, ist eine Gegenfärbung für die nicht verholzten Gewebe. Dies möchte ich, wie oben schon mit Klaus und Rolf-Dieter diskutiert, mit Eosin und Nelkenöl versuchen.
To be continued! 

Anregungen und Kritik sind wie immer willkommen!

Herzliche Grüße
Jörg

[Jürgen H.]

Hallo Jörg,

Meines Wissens nach sind insbesondere Farbstoffe, die aufgrund elektrostatischer Effekte am zu färbenden Substrat anlagern, empfindlich gegen Restfeuchtigkeit. Hier vermute ich die Lösung für die beobachtete Ausbleichung.

Das ist ja interessant. Hättest Du vielleicht eine Quelle? Ich rätsele seit langem, warum bei mir die Pseudoazanfärbungen (Sterba Schobess) teilweise nach kurzer Zeit ausbleichen (im dunklen Kasten) teilweise jedoch über Jahre unverändert bleiben. Möglicherweise liegt hier des Rätsels Lösung...

Im Übrigen: Wunderschön differenzierte Bilder!

Mikrogrüße

Jürgen

[Fahrenheit]

Hallo liebe Färberzunft,

gestern Abend hatte BEN bei mir auf dem Labortisch seinen ersten Auftritt. BEN steht für Brilliantkresylblau, Eosin und Nelkenöl.

Als Ausgangsmaterial mussten zwei Mikrotomschnitte des Clementinenfruchtstiels von Rolf-Dieter Müller herhalten, die ich noch vorrätig hatte.

Hier in kürze der Arbeitsablauf aus meinem Laborbuch.

Zunächst eine Testfärbung nur mit in Nelkenöl gelöstem Eosin:
- Ansatz: eine kleine Spatelspitze Eosin in 4 Tropfen Nelkenöl
- Entwässern des Schnittes in Isopropanol (3 mal wechseln)
- Färbung im EN Ansatz für 15 Minuten
- Ausspülen des Farbansatzes in Isopropanol (4 mal wechseln)
- Eindecken mit Euparal
- Photodokumentation (100x, BW 13.8, Stapel aus 13 Einzelbildern)

Bild 19: Das ganze sieht dann bei hundertfacher Vergrößerung so aus (Stapel aus 13 Bildern)


Und hier ein erster Test des kompletten Färbeverlaufs:
- Wässern des Schnittes (Clementinenfruchtstiel), 2 mal wechseln.
- Färbung für 10 Minuten in BKB Lösung ca. 1,25 % (2 Tropfen Stammlösung + 2
 Tropfen Aqua dest.)
- Entwässern in Isopropanol - der Schnitt ist komplett blau
- Überführen in Eosin-Nelkenöl (Ansatz wie oben), Färbung auch hier für ca.
 10 Minuten
- BKB geht in Schwaden ab, die EN Lösung behält dabei ihren Farbton und
 färbt nicht nach lila um
- Lupenkontrolle: verholzte Gewebe bleiben blau, EN zieht auf die
 unverholzten Gewebe auf und hat dort wahrscheinlich das BKB verdrängt
- Spülen in Isopropanol (4 mal wechseln, die ersten beiden Chargen färben
 sich leicht rosa vom EN-Farbansatz, 3 - weitestgehend -  und 4 bleiben
 klar)
- Eindecken mit Euparal
- Photodokumentation (100x, BW 13.8, Stapel aus 13 Einzelbildern)

Bild 20: Das Ergebnis ist noch nicht optimal (Vergrößerung ebenfalls 100x, Stapel aus 12 Bildern)


Ich finde, das Eosin kommt im BEN Schnitt sehr matt und ins lila gezogen daher. Das liegt wohl daran, dass das BKM nicht ganz spezifisch aufzieht, da es auch Zellulose anfärbt, die in allen Zellwänden enthalten ist. Die durch das Nelkenöl erwartete Differenzierung des BKM ist jedoch noch nicht stark genug. Vielleicht lässt sich da über Konzentrationen und Färbedauer noch etwas machen.

Das BKB ist gewohnt brilliant und ich hoffe, das bleibt auch so  

Bild 21: Zum Vergleich noch einmal ein altes Bild vom gleichen Material in einer klassichen Etzold FCa Färbung, ebenfalls bei huntertfacher Vergrößerung (Einzelaufnahme):


Gegenüber der Etzold FCA Färbung, die farblich quasi ein Negativbild der BEN Färbung ist, fällt auf, dass sich die Cuticula deutlich besser abhebt. Allerdings sind im BEN-Bild die Strahlen im Holzteil nicht zu unterscheiden, was mit Etzold FCA (und auch Etzold grün, da noch besser) sehr wohl gelingt.
Ohne eine verbesserte Differenzierung des BKB im Färbeprozess bring BEN also als Universalfärbung keine Vorteile und kann nach meinem Empfinden auch ästhetisch nicht mithalten.

Lieber Jürgen,
leider habe ich das von Dir gewünschte Zitat noch nicht wieder gefunden. Ich habe in der letzten Woche lange im Netz gesucht, um etwas zur Instabilität des BKB zu finden. Der Text war allgemein gehalten, daher habe ich ihn nur überflogen und nicht kopiert. Das war wohl ein Fehler  .

Kommentare und Kritik sind wie immer willkommen.

Herzliche Grüße
Jörg

[Fahrenheit]

Hallo liebe Färberzunft,

hier nun der nächste Versuch einer BEN Färbung. Um das Ausbleichen des Eosins zu verhindern, habe ich zur Sicherheit frisches Eosin verwendet und statt über Isopropanol ins Euparal über Xylol in Kanadabalsam eingeschlossen.

Meinen herzlichen Dank an Rolf-Dieter Müller für die Unterstützung und die schönen Mikrotomschnitte 

Das Objekt ist diesmal ein Lavendelstängel im Querschnitt in 70% Ethanol.

Hier das neue Rezept:
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben in BKB 0,125% für 5 Minuten
- Entwässern in Isopropanol (4-mal wechseln, insgesamt 10 Minuten)
- Färbung in Eosin/Nelkenöl für 20 Minuten (Ansatz wie in einem der
  vorangegangenen Postings beschrieben)
- Überführen der Schnitte in Xylol, vorsichtig mit dem Pinsel bewegen, um
  das Eosin/Nelkenöl zu entfernen (10 Sekunden)
- Abziehen und Xylol nachgeben (3-mal wechseln, insgesamt 15 Minuten)
- Einschließen in Kanadabalsam

Und hier nun die Ergebnisse, die sich, wie ich denke, sehen lassen können:

Bild 22: Übersicht über das Präparat, Vergrößerung 40x, Stapel aus 3 Bildern.


Bild 23: Ausschnitt mit Leitbündel in einer der Ecken des Schnittes, Vergrößerung 100x, Stapel aus 12 Bildern


In der neuen Kombination Xylol und Kanadabalsam kommen die beiden Farben sehr schön leuchtend zur Geltung. Xylol ist weit weniger polar als Isopropanol, daher vermute ich, dass es die Eosinfärbung nicht oder nicht so sehr angreift.

Die Präparate sind ganz frisch: man beachte die Tüpfelspuren wandernder Teilchen, die durch das Stacken entstanden sind.

Herzliche Grüße
Jörg 

[Klaus Herrmann]

Hallo Jörg,

das ist ja eine Wucht, damit stellst du die sonst übliche Farbgebung auf den Kopf. Unglaublich wie farbstark das Eosin kommt!

Ich denke auch, dass es am Xylol liegt. Ich habe auch die Beobachtung gemacht, dass Färbungen in den Eindeckmitteln Malinol, Kanadabalsam, Eukitt leuchtener wirken nach Verdunsten des Lömis als bei Euparal, obwohl das unbestritten Vorteile in der Anwendung hat.

Dass BKB scharf und intensiv färbt ist ja klar!