Praktische Erfahrungen mit Isopropanol?

[Ralf Feller]

Liebe Kollegen,
ich bin gerade dabei einige Gewebeproben in Paraffin einzubetten. Bisher ging ich immer über Ethanolstufen bis zu 100% Ethanol,
dann Xylol, Xylol+Paraffin 1+1 und dann in Paraffin (Paraplast).
Nun habe ich den abs. Ethanol durch Isopropanol ersetzt und lese,
dass es auch möglich ist von hier in Isopropanol+Paraffin 1+1 und dann in Paraffin zu gehen, also auf Xylol zu verzichten.
Hat jemand praktische Erfahrungen damit?

Gruß Ralf

[Jürgen H.]

Lieber Ralf,

wenn Du nach wie vor Insekten einbettest, dann probiere unbedingt einmal Folgendes aus:

Iso statt Alkohol in Stufen 70, 90, 2x100, dann
Iso Butylalkohol N Gemisch 1/2 ,1/2
Butylalkohol N rein zwei oder dreimal
Paraffin Butylalk. N kalt, dann warm 1/2 1/2
dann in Paraffin.

Ich habe einige Zeit für andere Wege verplempert und jetzt bei Kontrolle meiner Aufzeichnungen und meiner Präparate festgestellt, dass der Weg über Butylalkohol zu den mit Abstand besten Ergebnissen geführt hat, vor allem die wenigsten Splitterungen des Chitins und die geringsten Schrumpfungen mit sich gebracht hat.

Ganz wichtig scheint mir zu sein, lange Zeiten zu verwenden. Ronald Schulte hat hierzu ja schon den 12 Stunden Rhythmus vorgeschlagen. Bei unseren Insekten hängen die langen Zeiten zusätzlich offenbar damit zusammen, dass sie vollständig, aber auch wirklich vollständig entwässert sein müssen, da sonst das Chitinskelett anscheinend überaus hart wird. Und Ethylalk. scheidet wohl aus dem gleichen Grund aus, ebenso Xylol.

Über Iso ins Paraffin zu gehen, funktiert prinzipiell auch, habe ich mehrfach so versucht, nur scheint die Löslichkeit nicht so gut zu sein, es bildeten sich jedenfalls bei mir mehrfach Lücken in der Paraffindurchtränkung.

Herzlichen Gruß

Jürgen

[Dieter Stoffels]

Hallo Ralf,

von einem Gebrauch des Isopropanols als Intermedium rate ich Dir ab. Da, wie bereits beschrieben, Isopropanol erheblich geringere Mengen an Paraffin (Schmelzpunkt 58 Grad Celsius) zu lösen vermag, werden "kompaktere" Gewebe in der Regel nicht vollständig mit dem Paraffin infiltriert. Das Lösungsvermögen hängt hierbei vom Schmelzpunkt des verwendeten Paraffins ab. Ein erfolgreicher Einsatz von Isopropanol als Intermedium ist möglich bei sehr kleinen Objekten (embryolales Gewebe, usw.) oder bei Hölzern, bei denen andere Intermedien eine zu starke Härtung verursachen.

Der Gebrauch von Butanol (Butylakohol) stellt eine gute Alternative dar. Hierbei sollte aber tertiäres Butanol eingesetzt werden, da die primären und sekundären Butanole Paraffin schlechter lösen. Die Gewebe werden in tertiärem Butanol nur im geringem Maße gehärtet und lassen sich anschließend gut schneiden. Auch bei der Herstellung von Schnitten durch Insekten leistet Butanol gute Dienste. Vor der endgültigen Paraffineinbettung sollte aber eine Butanol:Paraffinmischung bei einer Temperatur zwischen 50-60 Grad Celsius mehrstündig angeboten werden.

Neben den bereits beschriebenen Lösungsmitteln habe ich auch gute Erfahrungen mit der Verwendung von Rotihistol (Firma Roth) als Paraffinintermedium gemacht. Die Schneidbarkeit der Gewebe entspricht der einer Butanolbehandlung.


Viele Grüße!

Dieter

[Ralf Feller]

Hallo Jürgen, Hallo Dieter,
danke für den Tipp mit dem Butylalkohol!
Leider habe ich gerade keinen Butylalkohol zur Hand, werde ihn aber bestellen. Ich habe heute zum ersten mal Isopropanol anstelle von absolutem Ethanol als letzte Entwässerungsstufe eingesetzt und dachte nun ich könnte mit das Xylol sparen. Habe aber gerade beim Googeln einen Hinweis gefunden, dass Paraplast nicht in Isopropanol löslich ist, in anderen Arbeiten lese ich die erfolgreiche Anwendung von Isopropanol als Intermedium für Paraplast.
Da ich gerade beim Einbetten bin, habe ich 2ml flüssiges Paraplast mit 2ml Isopropanol versetzt und auf 70°C erwärmt. Es entsteht keine klare Lösung. Es entsteht eine milchige Flüssigkeit, obwohl sich der größte Teil des Paraplst wohl gelöst hat. Für heute werde ich wohl den Xylolweg wieder gehen weil ich davon gerade genug habe, werde aber den Butylalkohol ausprobieren.

danke, Gruß Ralf

[Segu]

Laut Herstellerangabe soll man Paraplast nicht über ~60°C erhitzen.

Die 70°C scheinen mir da doch zu hoch!?

[Jürgen H.]

Hallo Ralf,

Könnte es sein, dass Dein Iso nicht vollständig wasserfrei ist? Das wäre im Hinblick auf den gesamten Präparationsvorgang von Übel und zu prüfen.

I.Ü. hat Dieter Recht: Ich habe oben eine Stufe Mischung zwischen Paraffin und Butanol warm vergessen und im Text eingefügt.

Tertiäres Butanol müsste ich ausprobieren. Bisher hat mich davon abgehalten, dass es bei Zimmertemperatur nicht flüssig ist. Es muss wohl auch, so entnehme ich jedenfalls diversen Präparationsvorschriften, sukzessive in diversen Alkoholbeimischungen angeboten werden? Ich habe es daher bisher beim N Butanol belassen. Roti habe ich auch ausprobiert, allerdings im Unterschied zu Dieter mit schlechterem Erfolg als mit N-Butanol. Vielleicht liegt dies daran, dass sich Roti anschließend schlechter aus dem Paraffin beseitigen lässt als Butanol und/oder ich hier nicht gründlich genug war? (Obgleich meine nicht gerade kleine Nase vom Roti beim letzten Paraffinbad nichts mehr geschnüffelt hat)

Mikrogrüße

Jürgen

[Ralf Feller]

@ Michael
danke für den Hinweis, so genau habe ich das Datenblatt zum Paraplast wohl nicht gelesen, habe gerade die Temperatur auf 63°C runterreguliert. Viel tiefer kann ich aber nicht gehen weil mein Paraplat bei 58°C fest wird.

@ Jürgen,
ja die Sache mit dem Restwasser kann problematisch sein. Auf der Isoflasche steht p.A. aber es kann Wasser gezogen haben. Mit Xylol ist es aber zu mischen ohne das eine Trübung entsteht. Kann nicht gerade auch Butanol im Vergleich zu Xylol relativ viel Wasser enthalten? Manche Dinge sind recht hygroskopisch, ich weiß nicht wie es mit Butanol ist. Einen Wasserindikator habe ich nicht.

Gruß Ralf

[Ronald Schulte]

Neben den bereits beschriebenen Lösungsmitteln habe ich auch gute Erfahrungen mit der Verwendung von Rotihistol (Firma Roth) als Paraffinintermedium gemacht. Die Schneidbarkeit der Gewebe entspricht der einer Butanolbehandlung.

Dieter,

Ihren Beitrag über Isopropanole kann ich ganz unterschreiben. Gleiche Erfahrungen habe ich auch nurrrrr....
habe ich gerade eine Flasche Rotihistol bekommen und habe noch keine Erfahrungen damit.
Meine Frage: "dringt Rothihistol gleich schnell ein wie Xylol und haben Sie auch Erfahrungen gemacht mit größere Gewebestücke?" (ich mag es gerne um das Gewebe so groß wie möglich ein zu betten und zu Schneiden weil Mann dann die gesamtstruktur behalten kann und mit eine übersichtsfärbung wunderbar Studieren kann).

Grüße Ronald 

[Jürgen H.]

Hallo Ralf,

N-Butanol ist im Gegensatz zum tertiären B. nicht hygroskopisch, sogar nur schwer mit Wasser mischbar, lässt sich also wasserfrei halten.

Wenn Dein Iso mit Xylol mischbar ist, müsste es weitgehend wasserfrei sein, da Xylol ja  nur geringe Mengen Wasser verträgt.  Dann stehe ich ehrlich gesagt bei Deiner Beobachtung vor einem Rätsel. Mein Paraffin mischt sich ohne weiteres 1/2  1/2 mit Iso bei 60 Grad, hab jedenfalls damit nie Probleme mit gehabt. Ich verwende allerdings das Paraffin aus dem Jung Histoshop. Wie auch immer: Die Infiltration mit Iso funktioniert zwar prinzipiell, wird auch z.B. im Romeis geschildert, ist aber für Insekten ohne weiteres Intermedium nach meinen Erfahrungen nicht optimal.

Mikrogrüße

Jürgen

[Dieter Stoffels]

Hallo Ronald,

das schnelle Eindringverhalten von aromatischen Lösungsmitteln in Gewebe lässt sich meiner Erfahrung nach durch keines der bekannten Ersatzintermedien erreichen. Das gilt auch für das Rotihistol, das bei Zimmertemperatur eine vergleichsweise hohe Viskosität besitzt. Aus diesem Grunde würde ich Dir empfehlen, den Übergang von Isopropanol oder Ethanol in Rotihistol bei Zimmertemperatur durchzuführen. Auf diese Weise kann sich das leichter diffusible Isopropanol im Gewebe gegen das höherviskose Rotihistol austauschen ohne das es zur "Trockeneffekten" in tieferen Gewebeabschnitten kommt. Nach einem Wechsel in reines Rotihistol empfehle ich Dir eine Rotihistol-Paraffinmischung bei 60 Grad Celsius anzubieten. Bei dieser Temperatur erniedrigt sich die Viskosität des Rotihistol deutlich, so dass auch große Probenstücke vollständig infiltriert werden können. Im Unterschied zum Xylol müssen die Inkubationszeiten erheblich gesteigert werden und die Probengebinde ab und zu geschüttelt werden. Ich bette hierbei in 12 Stunden-Intervallen um. Der Vorteil des Gebrauches von Rotihistol- oder Butanoleinbettung ist in der guten Schneidbarkeit zu sehen. Der Preis für diese gute Schneidbarkeit zahlt man in Form der Zeit, die man für die Infiltration aufbringen muss. Besonders deutlich zeigt sich der Vorteil dieser Intermedien beim Schneiden entkalkter Hartgewebe wie Knochen, Knorpel, usw.

Viele Grüße!

Dieter Stoffels


PS: Leider bin ich der holländischen Sprache nicht mächtig, obwohl ich nahe der holländischen Grenze wohne. Bitte entschuldige, dass ich nicht in Deiner Sprache antworten konnte.

[Ronald Schulte]

Dieter,

Danke für die Info. Die Temperatur von 60°C ist kein Problem weil ich mich gerade ein Spezielle Histo Heizplatte bestellt habe. Paraplast darf nicht wärmer sein wie 62° so durfte das kein Problem sein.
Wenn das eindringen länger dauert macht mir auch wenig. Für größere Stücke schalte ich meist um nach 24st Zyklen oder sogar 48st.
Das es Besser schneidet höre ich wohl sehr gerne. Schade nur das meinen letzten Blöcke gerade TCA entkalkte Mausköpfe sind die mit vertrautes Xylol behandelt sind.
Ich werde es mal probieren.

Das sie kein Holländischen schreiben können macht mir total nichts aus. Ich komme auch sehr nahe an die Deutsche grenze und mein Vater hat uns immer auf Urlaub usw mitgenommen um uns Internationaler zu machen, weil nur holländisch nicht genug wäre, meinte ehr. Da habe ich jetzt Größen vorteil, er hatte recht!

Grüße Ronald

[Jan Kros]

Hallo Ronald,

Habe diesen interessanten Beitrag gelesen.
Ich verwende n-Butanol asl Zwisschenmedium und zwar über 4 Stufen.
Das fixierte material wird entwässert mit alkohol 96% 2 Stufen, dann Iso 2 Stufen und ann 4 Stufen n-Butanol
Dan geht es in in das Paraffin (Paraplast) bei 60°C, auch wieder 4 Stufen damit der Butanolgeruch völlig weg ist.
Dann giesse ich die Blöcke.

Ich habe bemerkt das entparaffinieren mit Rotihistol etwas länger dauert wie mit xylol, aber rotihistol ist besser für die Gesundheit und ich lasse mich einfach mal Zeit.
Entparaffinieren von Pflanzenschnitten von 10µ dauert bei mir 15 min.

Herzlichen Gruss und schöne Feiertagen
Jan Kros

[Ronald Schulte]

Jan,

Butanol ist bei mir noch eine Unbekanntheit aber also sicher brauchbar. Wo bekommt Mann ein Liter? Bei Fiers in Belgien sehe ich 1 Liter 1-Butanol für satte €33,- und dann kommen 21% BTW und den Versand noch dabei.
Bei Chroma sprich Mann über Primair, Secundair und sogar Terziaires Butylalkohol. Wass sind die unterschieden?

Höre nochmal gerne von dich,

Grüße Ronald

[Dieter Stoffels]

Hallo Ronald,

Die Bezeichnungen primäres, sekundäres und tertiäres Butanol geben an, wie das Butanolmolekül aufgebaut ist. Das primäre, sogenannte n-Butanol besteht aus einer linearen Kohlenwasserstoffkette mit endständiger OH-Gruppe. Beim sekundären Butanol gibt es eine seitliche Methylverzweigung. Das tertiäre Butanol ist am kompaktesten gebaut und besteht aus einem Kohlenstoffatom an dem sich drei Methylgruppen und eine OH-Gruppe befinden. Diese kompakte Struktur verleiht dem tertiärem Butanol "Kugeleigenschaften". Diese Kugeleigenschaften sind für die höhere Paraffinlöslichkeit und das raschere Eindringen in das Gewebe verantwortlich. Leider wird das tertiäre Butanol bei einer Temperatur kleiner 16 Grad Celsius fest (siehe oben), was beim Arbeiten in Kellerräumen zu berücksichtigen ist.

Wenn Du mit Butanol arbeiten möchtest, so nehme das tertiäre Butanol (auch wenn es deutlich teurer ist).  Die Firma Chroma ist hierbei eine gute Lieferadresse!

Viele Grüße!

Dieter

[Ronald Schulte]

Dieter,

Dank für die Erklärung. Dann bleibe ich doch beim pure Xylol denke ich. Das ist viel billiger und sehr gut!

Grüße Ronald