Fluoreszenz und Blitzen

[Diana1982]

Hallo Zusammen und ein frohes Neues Jahr!

Erst kürzlich habe ich angefangen mich mit Fluoreszenzanwendungen am Mikroskop zu beschäftigen. Schuld ist Peter mit seinem Acridin-Orange, das er mir gegeben hat 
Mein Hauptinteresse liegt dabei in der Beobachtung und Fotografie bewegter Objekte, sprich Tümpeltierchen. Soweit so gut.

Schon beim ersten Foto-Modell vermisste ich allerdings die Möglichkeit, blitzen zu können.

Ich habe unten zwei Bilder angehängt, die ich hier schon einmal gezeigt habe: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=42231.msg316235#msg316235)
Das erste Fluoreszenzbild zeigt grüne Pantoffeltierchen (Paramecium bursaria) kurz vorm Platzen, also völlig plattgedrückt. Fotografiert hätte ich sie lieber in Bewegung, siehe zweites Foto (DIC) als Beispiel. Da komme ich allerdings mit den Belichtungszeiten nicht hin.

Nach kurzem Googeln stieß ich auf folgende Seite:
https://www.nimmervoll.org/fluoreszierende-liquid-art-fotos-mit-uv-blitz/

Prima, es gibt prinzipiell schonmal Möglichkeiten  So einen UV-Blitz scheine ich auch zu brauchen!

Habt Ihr Erfahrungen, könnt Ihr ein Modell empfehlen oder seht Alternativen?

Ich freue mich auf Eure Antworten 
LG Diana

[Michael L.]

Hallo Diana,

Frohes Neues Jahr! interessante Anregungen. Ich denke die "speziellen UV Blitze" sind ganz normale Blitze bei denen der UV Filter entfernt wurde. Jeder konventionelle Blitz mit Entladungsröhren hat einen gelben UV Filter eingebaut, für Mechanik Profis wie Dich dürfte es kein Problem sein ein Gerät entsprechend zu modifizieren.

Viele Grüße

Michael

[jochen53]

Hallo Diana,
die Xenon-Entladungsröhre eines Elektronenblitzgeräts erzeugt neben dem sichtbaren Spektrum mit hoher Farbtemperatur auch relativ viel UV-Strahlung, die bei der normalen Fotografie unerwünscht ist. Durch die Filterwirkung der Streuscheibe wird sie abgeschwächt, manchmal hat man auch die Röhre bedampft oder beschichtet. Ich könnte mir aber gut vorstellen, daß man mit einem ganz normalen einfachen Blitzgerät ohne die vordere Kunststoff-Streuscheibe, dafür aber mit einem UV-durchlässigen "Schwarzlicht-Filter" (z.B. aus einer LED UV-Taschenlampe) davor, genügend UV-Strahlung für die Fluoreszenzanregung bekommt. Irgendeine Belichtungsautomatik wird sowieso nicht funktionieren, das müßte man ausprobieren. Für die analoge Fotografie gab es damals sehr aufwendige und teure Geräte, bei denen man die Blitzleistung in mehreren Stufen, meistens mit Faktor 2, reduzieren konnte oder sogar Stroboskop-Aufnahmen machen konnte. Diese Geräte sind heute praktisch nur noch Elektronik-Schrott, weil sie niemand mehr benötigt und sie an digitalen Kameras nicht mehr verwendet werden können.

Viele Grüße und ein gutes Jahr 2022,
Jochen

[wilfried48]

Liebe Diana,

du hast doch Blauanregung also wozu einen UV Blitz ?

Das Problem dürfte eher die Intensität sein. Wie groß ist denn im Moment deine Belichtungszeit bei Autofluoreszenz und bei welcher Beleuchtung (blaue LED ?, HBO ?). Ich gehe mal vom Sekundenbereich aus.

Diese Lichtmenge müsste der Mikroblitz im 0,1 msec Bereich und kleiner liefern.

viele Grüße und ein frohes und erfolgreiches 2022

Wilfried

[Peter V.]

Liebe Diana,

ich verstehe gerade nicht, wie Du auf UV kommst? Du regst doch mit dem I3-Würfel mit Blaulicht an und das ist natürlich im Blitz genau so enthalten wie (sogar) in der Halogenleuchte. Grundsätzlich müsstet Du also nur die Fluoreszenz-Auflichtleuchte durch einen Blitz ersetzen, die Frage ist lediglich, ob Du in der zum Einfrieren der Bewegung notwendigen kurzen Abbrennzeit des Blitzes genügend Licht zum Fotografieren zur Verfügung hast.
Ohne mich damit je wirklich beschäftigt zu haben, wäre mein erster Gedanke, eher die Durchlicht-Fluoreszenz zu nutzen. Dazu könntest Du den I3 belassen, würdest aber im Durchlicht arbeiten. Es müsste ein seprater Erregerfilter (wie er im I3 verbaut ist) in den Durchlichtstrahlengang gebarcht werden. Du müsstest mal in der Liste nachschauen, welcher Erregerfilter im I3 sitzt und Dir einen solchen beschaffen.
Ob das alles geht, weiß ich nicht; ich kann mir fast gar nicht vorstellen, dass das nicht schon einmal jemand probiert hat.

Soweit ich weiß, hast Du derzeit keinen weiteren Blitz, der Dich auf "dumme Gedanken" bringen könnte!  Bevor man an einem Blitz bastelt bzw ihn öffnet, muss man genau wissen, was man tut!! In einem Blitz können potenziell lebensgefährliche Spannungen auch in ausgeschaltetem Zustand (Kondensator) auftreten.

Herzliche Grüße
Peter

[Diana1982]

Na gut,

Ich gebe zu, dass sowohl das Thema Blitzen als auch Fluoreszenzmikroskopie für mich immer etwas "suspekt" waren.
Fluoreszenz hat mich zudem vor der Acridin-Orange-Lieferung nicht so sehr gereizt, als dass ich mich damit näher hätte beschäftigen mögen. Das wird sich aber ändern.

Das Blitzen hat irgendwann endlich einmal mit regenbogenstreifenarmen Bildern und mehr oder weniger genug belichteten Bildern sowie einem akzeptablem Weißabgleich im Hellfeld, Phasenkontrast und auch im DIC geklappt und ich war ganz zufrieden  Mehr brauchte ich ja auch nicht.
Jegliches Herumgestelle an den Blitzeinstellungen (Blitzleistung etc.) und der Blitzpostion hat mein Ergebnis eher verschlechtert.
Also habe ich nach dem Motto "lieber nichts mehr anfassen" weitergemacht.
Bei Fluo-Versuchen, die aber schon länger her waren, habe ich, was das Thema Blitzen angeht, keinen Erfolg gehabt und habe es dann verworfen, weil ich dachte, es geht halt aus irgendwelchen Gründen nicht.
Was die Ursache war, weiß ich nicht. Vielleicht einfach "zu blöd angestellt". Vielleicht war der ganze Aufbau auch ungünstig.

Danke für Eure Aussagen, auch den normalen Blitz ohne Umbau verwenden können zu müssen, ich mache bei Gelegenheit nun doch weitere Versuche am Orthoplan, für das ich sogar einige Durchlichtschieber habe.

Für mein DMR fehlt mir eine Blitzadaption noch gänzlich, die wird als nächstes fällig sein 

LG Diana

[Diana1982]

Das Problem dürfte eher die Intensität sein. Wie groß ist denn im Moment deine Belichtungszeit bei Autofluoreszenz und bei welcher Beleuchtung (blaue LED ?, HBO ?). Ich gehe mal vom Sekundenbereich aus.

Hallo Wilfried,

Je nach ISO und Leuchtkraft der Viehcher zwischen 2 Sek. und 0.10 Sek.
Also, weitere Versuche mit dem "normalen" Blitz werden folgen! Danke Dir 

LG Diana

[reblaus]

Hallo Diana -

wunderschöne Bilder!
Im vorigen Jahrtausend haben wir Fluoreszenzuntersuchungen an Rebblättern gemacht um die Einwirkung von Photosynthese hemmenden Herbiziden nachzuweisen, aber das war längt nicht so ästhetisch.
In diesem Zusammenhang meine Frage: Wie lange kannst du in deinem System belichten bevor die Fluoreszens nachlässt?

Viele Grüße

Rolf

[Peter V.]

Liebe Diana,

äh..nochmal: Ich bin weder großer Blitz- noch Fluoreszenzexperte. Bevor ich Dich also auf eine falsche Fährte locke und mißverstanden werde: Du müsstest ja in der extrem kurzen Belichtungszeit, die zum "Einfrieren" erforderlich ist, die Ciliaten mit einer so enormen Lichtmenge anregen, dass das von ihnen abgestrahlte Fluoreszenzlicht ausreicht, um ein Bild auf den Chip zu bekommen. Gefühlsmäßig würde ich sagen: Das geht nicht. Wenn, dann noch am ehesten im Durchlicht, aber auch da kann ich mir nicht vorstellen, dass es geht. Oder Du besorgst eine Kamera mit 1 Mio ISO 

Hat das denn (also Blitzen für Fluoreszenz)  überhaupt mal jemand probiert oder ist der Gedanke völlig abstrus?

Herzliche Grüße
Peter

[Diana1982]

Na toll!
Gerade hatte ich noch gehofft, dass ich einfach zu "ungeschickt" und "untalentiert" war.
Nun das!   

[reblaus]

Hallo Diana -

ergänzend zu den Bedenken von Peter möchte ich noch anmerken, dass die Rotfluoreszenz nicht einfach von dem "Farbstoff" Chlorophyll herrührt, sondern vom gesamten, recht komplizieren Photosynthesesystem, von dem das Chlorophyll nur einen Teil darstellt. Es kann nur Licht bis zu einem bestimmten Maximum verarbeiten.
             Wir haben bei unseren früheren Untersuchungen zum Fotografieren einen Restlichtverstärker und zum Messen einen SEV verwendet.
             Allerdings handelte es sich bei uns um verzögerte Fluoreszenz: Nach Blockieren des Erregerlichts verschwindet diese nämlich nicht sofort, sondern flaut binnen einiger sec ab. Dies könnte bei unbewegten Objekten hilfreich sein, wenn der Kameraverschluss länger offen bleibt, aber in deinem Fall geht es ja um das Einfrieren der Bewegungen.

Und trotzdem: An deiner Stelle würde ich das Blitzen trotz all unserem Geunke austesten!

Gruß

Rolf

[Peter V.]

Lieber Rolf,

Und trotzdem: An deiner Stelle würde ich das Blitzen trotz all unserem Geunke austesten!

wie ich Diana kenne, macht sie das schon  Und wahrscheinlich wird sogar noch etwas dabei herauskommen...

Herzliche Grüße
Peter

[Christian R.]

Liebe Diana,

Deine Idee mit der Blitzröhre für Fluoreszenz ist nicht schlecht, ich habe vor einiger Zeit zu diesem Thema Versuche gemacht mit folgenden Hintergedanken:
1)   Xenonröhren haben ein kontinuierliches Spektrum, man würde sich daher das Wechseln von LEDs je nach Anregungswellenlänge ersparen.
2)   Protozoen überleben intensives UV- und Blaulicht nicht sehr lange, ein kurzer Blitz ist da „schonender“.
3)   Weniger „bleaching“ von Fluoreszenzfarben.
4)   „Einfrieren“ von schnellen Bewegungen.

Leider sind die Tests ziemlich ernüchternd verlaufen, im Prinzip muss man mit 1/1 (volle Leistung) und/oder höheren ISO Einstellungen blitzen.

Übrigens kurz noch zum Thema UV: bei Consumer Blitzgeräten wie z.B. der Yongnuo Speedlite Familie wird gnadenlos der Rotstift angesetzt, UV-beschichtete Blitzröhren würden extra Kosten verursachen, den UV-Schutz übernehmen daher wie schon weiter oben erwähnt die Kunststoffstreuscheiben, wenn man diese entfernt hat man einen „UV-Blitz“ ohne Extrakosten
Hier ist das Absorptionsspektrum einer Yongnuo Blitzröhre, der Glaskörper ist bis 320 nm noch gut durchlässig.



Hier sind nun einige Beispielaufnahmen, geblitzt wurde am Olympus BX60 mit einem Yongnuo Speedlite 565ex II, die Blitzröhre ist ausgelagert und vor einer weißen Cree XM-L2 U3 montiert, analog zu diesem wunderbaren Beitrag von Jochen:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=37407.msg275010#msg275010
Filterwürfel: Olympus U-MWB (Erregerfilter 450-480nm)
Kamera: Canon EOS 600D
100% am Fototubus
Testobjekt: Trieb der Ölweide quer, Wacker 3A, Eukitt
Alle Bilder sind nur „quick and dirty“ ohne Nachbearbeitung, es geht hier ja nur um die erforderliche Blitzleistung und ISO-Einstellung.

UplanFl 10x 0,3
Blitzleistung 1/4, ISO100
Ist zu dunkel


UplanFl 10x 0,3
Blitzleistung 1/1, ISO400


UplanFl 20x 0,5
Blitzleistung 1/1, ISO200


UplanFl 20x 0,5
Blitzleistung 1/8, ISO800


Weiters sind folgende Aspekte zu bedenken:
1)   Wacker gefärbte Schnitte fluoreszieren sehr kräftig, Autofluoreszenz und z.B. schwache Färbungen mit Acridinorange brauchen mehr Anregungslicht.
2)   Wenn man durch die Okulare gleichzeitig beobachten will verliert man zusätzlich Lichtstärke.
3)   Wenn der Blitz eingespiegelt wird verliert man mindestens 50% Lichtstärke.
4)   Objektive mit höherer Apertur und geringerer Vergrößerung brauchen weniger Anregungslicht, ein 40x 0,75 ist z.B. heller als ein 20x 0,5, ein 20x 0,75 ist heller als ein 40x 0,75. Ich habe daher mit Absicht den „worst case“, also Objektive mit geringer Apertur für die Tests verwendet.

Im Prinzip funktioniert also Fluoreszenz mit Blitzröhren, je nach Objekt, Objektiv und Blitzadaption muss man aber mit voller Leistung blitzen und hohe ISO-Werte an der Kamera einstellen. Ich verwende daher lieber für jede Anregungswellenlänge eine eigene LED.

L.G.

Christian

[Werner]

Die "normalen" Blitzröhren sind aus Glas, das den größten Teil des emittierten UV absorbiert, weil man es zum Fotografieren ja nicht braucht.

Für Fluoreszenzanregung gibt es relativ kleine Blitzröhren aus Quarzglas, die das UV durchlassen. Verbaut sind die z.B. in Fluoreszenzdetektoren für die HPLC. Der Kolben ist länglich, damit das Licht gut in den Eingangsspalt eines Spektrometers abgebildet werden kann (erscheinen manchmal bei ebay).
Es gibt aber auch kleine Röhren mit kleinem Kolben, die finden sich in Auto-Xenonlicht. Wenn man das Schutzrohr absprengt, hat man einen Quarzglaskolben übrig. Wegen der fast Kugelform wäre die Entladung leichter in eine runde Optik abbildbar.
Mit der Elektronik neuester Blitzgeräte (IGBT-Transistor) kann der Blitz nach einer gewünschten Zeit auch abgeschaltet werden, ohne daß der Speicherkondensator geleert wird. Mit entsprechender Modifikation der Elektronik kann man den Blitz gezielt einschalten und nach kurzer wählbarer Zeit wieder ausschalten. Eine komplette Blitzelektronik inklusive einer kleinen Blitzröhre findet man in fast jeder weggeworfenen Kamera, analog wie digital.
Vor etwa 40 Jahren habe ich einige Tausend Mikrofarad über eine ausgebaute XBO-150 experimentell entladen. Das war ein höllisch greller Blitz, man kann also auch mit einer XBO blitzen. Eine praktische Anwendung fehlte mir damals, deshalb blieb es beim Experiment.

Das soll nur eine Anregung für Baster sein, ich komme warscheinlich in nächster Zeit nicht dazu, obwohl es mich interessieren würde.

Gruß - Werner