Auliscus spec.- mit veränderten Einstellungen und gereinigtem Pluta-DIK

[Peter V.]

Hallo,

ich habe jetzt unzählige Male das REM-Bild und das DIK verglichen. Mir ist auch noch nicht ganz klar, was an dem DIK-Bild so artefaktisch sein soll, dass es nicht mehr akzeptabel wäre.

Herzliche Grüße
Peter

[Lupus]

Hallo Siegfried,

ich habe in einem Ausschnitt des Bildes Bereiche markiert die ich beschrieben habe, darunter zum Vergleich ein ähnlicher Ausschnitt der REM-Aufnahme. Zusätzlich habe ich die theoretische maximale Auflösung des verwendeten Objektives eingetragen. Der zentrale Bereich der Diatomee sieht so aus wie man es etwa erwarten würde.

Hubert

[anne]

Hallo Hubert,
ob das am DIC liegt?
Könnte doch auch am Stacken liegen?
Bzw. die Linien von den Polen zur Mitte zeigen diese Linien nicht, daher könnten diese doch auch  einfach im Unterschied zur REM Aufnahme vorhanden sein? Zudem sagt Sigi die Schale liegt etwas schief, das könnte auch die Ursache sein. Auf jeden Fall würde ich es nicht überbewerten, das Bild ist klasse, das ist für mich keine Frage.
lg
Anne

[Siegfried]

Hallo Hubert
und Anne und Peter
Um mir eine neuerliche Meinung zu bilden, muß ich mir die Auliscus nochmal
genau in mehreren Schichten anschauen.(Hellfeld und DIK)
Da ich aber heute noch was vorhabe, wird es erst morgen.
Ich melde mich wieder.
   Gruß von Siegfried

[Peter Reil]

Hallo,

ich glaube, hier liegt ein Missverständnis vor. Die drei aufgenommenen Diatomeen sind nicht dieselben.

Ein direkter Vergleich ist dann aussagekräftig, wenn man das selbe Exemplar mit verschiedenen Beleuchtungsverfahren (das möglichst auch noch selbst) aufnimmt.

Theoretische "Rechnerei", gar an fremden Bildern, mag zu eventuellen Wahrscheinlichkeiten führen, aber nicht zu einem korrekten Ergebnis.

Gruß
Peter

[Lupus]

Hallo Anne,

meine Kritik ist lediglich eine sachliche Feststellung, nicht der Versuch etwas überzubewerten  . Am Stacken an sich dürfte es nicht liegen, da durch das Stacken normalerweise keine schärferen Details erzeugt werden als in den Originalen irgendwo enthalten sind. Aber Stacken von DIK-Aufnahmen ist in sehr vielen Situationen problematisch bis nicht sinnvoll. Denn ein einzelnes DIK-Bild hat prinzipbedingt eine geringe Schärfentiefe und zeigt alle Phaseninformationen dieser Ebene vollständig in Form eines Helligkeitsverlaufes. Wenn ich aber bei einem relativ dicken Objekt alle diese DIK-Ebenen nur nach dem Auswahlprinzip der schärfsten Bilddetails überlagere kann oft nichts sinnvolles heraus kommen, was soll eine Summe von jeweils örtlich vom Programm herausgepickten Phasenverlaufsbruchstücken physikalisch für eine Bedeutung haben? Speziell wenn ich einen schief in der Raumtiefe verlaufenden starken Phasensprung wie im Beispiel der ausgeprägten Rippen der Diatomee habe. Da könnten eventuell diese scharfen Linien entstanden sein.

Natürlich kann man keinen direkten Vergleich mit der REM-Aufnahme machen da nur der Typ gleich ist aber nicht die Strukturdetails. Was man aber dort gut erkennt ist, dass die Rippen im mittleren Bereich eine geringere Höhe haben im Vergleich zum Randbereich. Und genau das hatte ich anfänglich bereits erwähnt dass beim Überschreiten einer bestimmten Grenze der Phasensprünge jedes Phasenkonstrastverfahren die Phasenverschiebung nicht mehr richtig direkt in Helligkeitswerte umsetzen kann sondern beginnt einen periodischen Hell-Dunkel-Wechsel zu zeigen. Und auch dadurch könnten in Verbindung mit dem Stacken künstliche scharfe Linien entstanden sein.

Man müsste sich einzelne ungestackte Fotos im Vergleich ansehen, um das Problem etwas besser bewerten zu können.

@Peter
Natürlich sind die drei Diatomeen nicht dieselben. Das ändert aber nichts am zulässigen Vergleich der Grundstrukturen der Diatomeen-Art aus dem REM-Bild und der Bewertung von scheinbaren Bild-Strukturen, die aufgrund der maximalen Objektivauflösung gar nicht vorhanden sein können.

Hubert

[Nochnmikroskop]

Nabend zusammen,
Zunächst einmal möchte ich Siegfried zu dem gelungenen Foto gratulieren. Es ist ja kaum zu glauben, das dieses "nur" mit NA 0,7 entstanden ist.
Ich habe versucht, ähnlich wie Hubert, beide Bilder zu vergleichen. Siegfrieds Bild wurde aus der Fotocommunity verwendet, das ist höher aufgelöst.
Zunächst habe ich die Bilder gedreht und vom Mittelpunkt der runden Strukturen in der Breite angeglichen. Außerdem habe ich die Bilder vergrößert, damit weniger Artefakte bei der Bearbeitung hinzukommen.
Dann wurden beide Maßstabsbalken in ein 0,2mü Balken verwandelt und mehrfach in beide Bilder hineinkopiert.
1. Die Maßstäbe scheinen leicht zu differieren, der vom REM scheint ca. 1/4 kürzer zu sein. Das kann natürlich auch an meiner Bearbeitung liegen.
2. Bei Siegfrieds Bild sind die Täler als schwarze Striche erkennbar. Interessanterweise alle im Bereich der 0,2 mm Auflösungsgrenze, unglaublich.
3. Die Löcher in den Kreisen der REM Aufnahme sind 0,2 mm im Durchmesser bzw. noch kleiner. Diese sind bei Siegfrieds Bild nicht sichtbar, was die Welt wieder zurechtrückt. 

Gerne können meine Auführungen korrigiert werden, wenn diese fehlerhaft sind.

Lg Frank

[anne]

Hallo zusammen,
das geht jetzt aber gewaltig ins Detail.
Ich verstehe Hubert voll und ganz, da ist eine Linie mehr zu sehen als im REM.
Das passiert im DIC oder auch durch das Stacken, oder durch die Schräglage.
Ich möchte aber sagen, dass man in meinen Bilder, wenn man diese soooooo genau unter die Lupe nimmt sicherlich auch viele solche "Artefakte" entdecken kann.
Das ist nun mal der Unterschied zwischen REM und Lichtmikroskopie mit dem Versuch über das Stacken die fehlende Tiefenschärfe auszugleichen.
Dabei entstehen dann sogar "schwarze Löcher", wo anscheinend keine sind  .
Es ist sicherlich ok, konstruktive Kritik zu üben bei einem ehrlichen Bild, jedoch sollte dadurch die Motivation Bilder zu zeigen nicht verloren gehen.
lg
anne

[Lupus]

Hallo Anne,

das geht jetzt aber gewaltig ins Detail.

aus meiner Sicht nicht, denn ich habe ja nur die Frage von Siegfried beantwortet, was ich mit den "vorgetäuschten Details" gemeint habe. Den Sinn vom letzten Beitrag von Frank verstehe ich aber überhaupt nicht.

...dass man in in meinen Bilder, wenn man diese soooooo genau unter die Lupe nimmt sicherlich auch viele solche "Artefakte" entdecken kann.

So genau habe ich das Bild eigentlich nicht unter die Lupe genommen, diese ungewöhnlichen kontrastreichen Streifenstrukturen fallen doch sofort ins Auge? Die Ausgangsfrage "Welchen Sinn hat eine DIK-Aufnahme bei einer so ausgeprägt räumlich strukturierten Diatomee?" war eigentlich absolut harmlos gemeint, eine Antwort was der Vorteil gegenüber normalem Hellfeld sein soll fehlt mir noch. Meine kritische Meinung zur Verwendung von vermeintlich auflösungssteigernden Beleuchtungsmethoden habe ich aber schon einmal auch ganz praktisch mit Hilfe von Diatomeen-Aufnahmen beschrieben (DIK ist in der Hinsicht mit schiefer Beleuchtung vergleichbar):
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=41469.msg305437;topicseen#msg305437

...jedoch sollte dadurch die Motivation Bilder zu zeigen nicht verloren gehen.

kann ich mir in diesem Fall nicht ernsthaft vorstellen. 

Hubert

[Nochnmikroskop]

Hallo zusammen,
na da habe ich ja was angerichtet, von Unverständnis über Zoooooom, bis Motivationsverlust, alles in einem Beitrag, ich entschuldige mich dafür.
Auf gar keinen Fall soll die Motivation hier Bilder zu zeigen geschmälert werden, ganz im Gegenteil.

Und im Prinzip hat ja auch Peter Reil recht, man sollte nur das selbe Diatomeen vergleichen, was wohl nicht gehen kann.

Dann ducke ich mich mal weg.

LG Frank

[Siegfried]

Hallo Hubert
und Mitdiskutanten
Ich habe mir jetzt abends nochmal die Auliscus sowohl im DIK,
als auch im Hellfeld ebenenweise angeschaut.
Die kontrastreichen Streifenstruckturen sind in mancher Ebene teilweise vorhanden,
oft aber auch nicht. Ich vermute durch das Stacken besonders beim DIK Bild, daß ich
zu viele Einzelfotos verwendet habe. Allerdings habe ich auch beim Hellfeld mit dem 60er Objektiv 
auf einzelnen Ebenen solch Streifen gesehen.
Siehe Bild im Anhang.
Eine Erkenntnis ist für mich, es gibt viel zu beachten, sehr viel, wenn man zufriedenstellende
Ergebnisse erreichen will.
Also mein alter Spruch: Es kann nur noch besser werden.
Und sachliche Kritik und Meinungen sind weiterhin willkommen.
Ich meine jetzt nätürlich meine nächsten Bilder.
Und noch zu Hubert:
" eine Antwort was der Vorteil gegenüber normalem Hellfeld sein soll fehlt mir noch"

Ich bin nach wie vor der Meinung, daß ich auch bei Diatomeen mit DIK mehr sehe als im Hellfeld, auch wenn einige wenige vorgetäuschte Details zu sehen sind.
Ich habe heute nochmals ein Hellfeldbild von dieser Diatomee angeschaut und mit dem REM Bild verglichen, da fehlt ja doch einiges was man nicht sieht.
Hingegen beim DIK Bild ist trotz Mängeln, vieles zu sehen, was ich auch im REM sehe.
Das ist meine Meinung.
Nochmals danke an alle, die mir hier bei diesem Thema geantwortet haben.
   Gruß von Siegfried

[rhamvossen]

Hallo Hubert,

Ich habe deinen interessanten Beitrag über die schiefe Beleuchtung mal wieder angeschaut. Du zeigst da schöne Beispiele mit ringförmige Beleuchtung im Vergleich mit schiefe Beleuchtung. Wäre die ringförmige Beleuchtung für Diatomeen vielleicht nicht das bessere Kontrastverfahren im Algemeinen? Oder hängt das zuviel von die Art Diatomee ab? Wenn man manche Diatomeen mit ringförmige Beleuchtung beobachtet, dann sieht man oft das z.B. feine Porenstrukturen viel mehr wie echte Poren aussehen, im Gegensatz zu schiefe Beleuchtung. Das wurde dann vielleicht auch im Vergleich mit DIK so sein? Beste Grüsse,

Rolf

[Bob]

Hallo zusammen,
ich finde den Vergleich von Lichtmikroskop- und REM-Bildern immer sehr interessant und aufschlussreich. Das Bild Siegfrieds finde ich sehr gut, es wäre mir aber klar, dass ich im feinsten Detail nicht alles für bare Münze nehmen dürfte, wo ich aber auch keinen Stress mit habe. In dem Moment, wo man ein REM-Bild von Diatomeen gesehen hat, ist doch klar, dass man mit dem Lichtmikroskop ein vergnügliches, aber etwas trübes Intrument verwendet.  DIK finde ich für Diatomeen durchaus gut, mir gefällt vor allem, wie unkompliziert und reproduzierbar ich zu einem guten Bild komme. Mit schiefer Beleuchtung bekomme ich ähnlich gute Ergebnisse hin, aber mit einer etwas fummeligeren Einstellung.

Viele Grüße,

Bob

[Lupus]

Hallo,

@Siegfried

Phasenobjekte sind generell ein Problem wenn man an die Grenze der Auflösung gehen möchte. Wenn ich große Phasensprünge im Objekt habe, benötige ich eigentlich kein Phasenkontrastverfahren wie das nach Zernike, DIK oder schiefe Beleuchtung. Dann erzeugt auch Hellfeld durch unvermeidliche Interferenzeffekte deutlichen Objektkontrast. Bei grazilen Wasserorganismen oder ungefärbten Gewebeproben ist das natürlich eher nicht der Fall, aber Diatomeen zeigen in höherbrechender Einbettung (oder in Luft  ) meist ausreichend Detailkontrast z.B. um auch kleine Öffnungen in den Schalen gut und objektgetreu aufzulösen.

Diese Diatomee hat dagegen ausgeprägte hohe Rippen speziell im Randbereich, also starke Phasensprünge an den Rippenkanten. Daher erscheint natürlich im Hellfeld ein Paar Linien, die die Rippenränder markieren. Das Bild von Ulf, das ich im Beitrag #8 gezeigt habe, demonstriert das sehr gut. Man muss sich eigentlich immer über die physikalischen Zusammenhänge im Klaren sein, wenn man im optischen Grenzbereich unterwegs ist. DIK erzeugt - wie schon beschrieben wurde - speziell in diesem Fall zusätzliche Probleme bei der Darstellung des Phasengradienten, es gibt keinen direkten Intensitätszusammenhang mehr. Richtig ist natürlich, dass diese Diatomee besonders im zentralen Bereich auch flache und dadurch kontrastarme Strukturen besitzt, wo man mit Hellfeld an seine Grenzen kommt.

@Rolf

Du hast mit Deinem Hinweis auf die ringförmige Beleuchtung auch nach meiner Einschätzung die beste Lösung angesprochen. Zumindest bei üblichen Diatomeenformen, und wenn man mit der Breite der ringförmigen Beleuchtung nicht übertreibt, ist das Verhältnis optische Auflösung /Objektkontrast da recht gut. Gleichzeitig gibt es keine richtungsabhängige Objektverfälschung, und Interferenzartefakte halten sich in vertretbaren Grenzen. Ich verwende für Diatomeen grundsätzlich kein richtungsabhängiges Verfahren wie schiefe Beleuchtung oder DIK. Beide Verfahren unterscheiden sich ja vom Bildergebnis her praktisch nicht. Bei richtiger, rauscharmer Belichtung und ggfs. Ausnutzung des Spielraums von RAW-Dateien habe ich noch keine Probleme mit zu geringem Kontrast gehabt.

Hubert

[deBult]

Interesting exchange on what we (think we) observe using different contrast techniques versus reality. A often ignored or  misunderstood topic!

Best, Maarten