bitte löschen, danke !

[Adalbert]

bitte löschen, danke !

[BentH]

Many years ago I was facing the task of counting platelets in a counting chamber with phasecontrast. An Ortholux with PhV objectives and Heine condenser could not handle the problem with a thick counting chamber and a thick coverglass. I ended up with using a Zetopan with Reichert Semplan objectives and a Polyphos condenser. This combination allowed plenty of working distance.

[Nochnmikroskop]

Hallo ADi,

ich denke Du kannst hier keine Objektive mit so hohen Na's verwenden.
Mit Deinem Mitutoyo 4x, oder 10x/0,28 oder ggf. 20x solltest Du brauchbare Ergebnisse erzielen können.

Vielleicht mal mit schiefer Beleuchtung probieren, oder hast Du eine Dunkelfeld-Möglichkeit?

Bei Bernstein-Inklusen kann man o.g. Objektive auch anwenden, und die Inklusen sind oft nicht plan.

LG Frank

[liftboy]

Hallo Adi,

das gleiche Problem hab ich auch :-( Die dickeren Objekte (Käfer, Zikaden, Raupen) sind schwierig einzubetten. Ich lege da einen handelsüblichen O-Ring 22mm°, 1,3mmdick auf einen Objektträger, fülle mit Malinolauf, bette das Objekt ein und deckel mit einem 24mm° Deckglas ein. Trotz sorgfältiger und sauberer Arbeit bilden sich doch immer wieder kleinste Bläschen im Einbettungsmittel, welche dann bei der Betrachtung stören. Beste Bildergebnisse hab ich mit einem Euromex Stativ mit Zeiss/J Epiplan Objektiven im DF-Auflicht erzielt; bei stark aufgehellten Objekten auch im HF-Durchlicht, wobei da die Bläschen weniger störend sind.

Grüße
Wolfgang

[Jürgen Boschert]

Hallo Adalbert,

es gibt von Lomo den 40er Wasserimmersionsachromaten, NA 0,75; der hat einen derart großen Arbeitsabstand, dass es bei "normaldicken" Präparaten manches Mal schwierig ist, genügend Wasser drunter zu bekommen. Vielleicht wäre das eine Option

[Nochnmikroskop]

Hallo ADi,

ich denke die Störungen durch das Deckglas und durch das Eindeckmittel lassen bei der Tiefe des Objektes nicht mehr Details erkennen, als mit dem 20x /0,42. Da bist Du ja schon theoretisch unter 1 µm Auflösung, das reicht eigentlich locker für die Krallen.

Mit Immersion kann man natürlich noch etwas mehr Details herausholen, denke ich. Aber ob es das dann bringt?
Der Tip von Jürgen könnte in die richtige Richtung gehen, vgl. z.B.  https://www.edmundoptics.de/f/olympus-water-immersion-objectives/15074/ Die aktuellen Olympus Objektive haben alle über 3 mm Arbeitsabstand, da braucht es schon einen dicken Tropfen am Anfang. 

Bin gespannt, ob Du da noch etwas mehr herauskitzeln kannst.

LG Frank

[A. Büschlen]

Hallo ADi,

warum bemühst du dich mit so schlechten Präparaten ab? Für deine Projekte kommst nicht um ein zielgerichtetes präprieren herum. Hier ein Beispiel: http://www.thrips-id.com/en/

Gutes Gelingen!

Arnold

[Lupus]

Hallo Adi,

das Präparat ist schon toll, nur ich habe keine passenden Objektive dafür.

Manchmal ist es einfacher, das Präparat an erhältliche Objektive anzupassen ....   

bin immer noch auf der Suche nach Informationen, welche Rolle die Immersion und das Deckglas beim Stacken spielen.

Natürlich eine große Rolle bei diesen etwas unrealistisch hohen NA bis zu 0.95. Da sind dann zehntel mm Deckglasdickenabweichung relevant, oder man verwendet ein Objektiv mit Korrekturring.

Hubert

[Nochnmikroskop]

Hallo ADi,

gib in der Suchfunktion einfach Deckglasdicke ein, da wirst Du fündig in allen Richtungen.

LG Frank

[Lupus]

Hallo Adi,

Fotos der Inklusen zeigen doch auch tiefe Objekte in einem ,,Einschlussmittel". Man muss aber zugeben, dass die meisten in kleinen ABMs abgebildet sind.

die Gesetze der Optik gelten nun einmal, unabhängig von Wunschvorstellungen. Entscheidend ist die bei zunehmender NA sprunghaft ansteigende Empfindlichkeit bezüglich der Eigenschaften des optischen Mediums, das durchleuchtet wird. Außerdem muss das Einschlussmittel stimmen. Ich habe ausdrücklich von NA im Bereich bis zu 0.95 gesprochen, Dein wiederholtes Beispiel mit dem 20x hilft da nicht weiter.

Beim Stacken gelten nicht grundsätzlich andere optische Gesetze. Wenn man dabei im relevanten Umfang die dazwischen liegende Schichtdicke verändert, ändert sich auch von Bild zu Bild die Abbildungsqualität. Und wenn jedes Bild sowieso schon unscharf ist, kann auch Stacken daran nichts verbessern.

Hubert

[Jürgen Boschert]

Hallo Adi,

Hubert hat es ja schon dargelegt: da gibt´s nichts zu probieren, das kann man berechnen. Es ist nun einmal so: Je höher der Korrektionsgrad und je höher die NA eines Objektives, umso empfindlicher reagiert es auf Abweichungen der Deckglas(Schicht)dicke. Die höheraperturigen Trockenobjektive mit der von Dir anvisierten NA zwischen 0,75 und 0,95 sind praktisch immer als Korrektionssysteme ausgeführt. Die stellt man ein, indem man sich in einem Präparat kleine, möglichst dunkle Punkte sucht und durch Drehen am Korrekturring auf höchsten Kontrast einstellt; das bedeutet, man kann die falsche Deckglasdicke visuell wahrnehmen!

In der alten Version Mikroskopieren von Anfang an von Zeiss wird auf S 42 ein Vergleichsbild gezeigt von korrekt und falsch eingestellter Deckglasstärke bei einem Planachromaten 63 / 0,9 korr.

[Jürgen Boschert]

Hallo Adi,

Mit Stacken habe ich mich noch nicht beschäftigt.

Nur um die Größenordnungen zurechtzurücken: Der Verstellbereich eines Objektives 63 / 0,9 geht von 0,11 bis 0,21 mm. Weit kommt man da nicht. Drei mm überbrücken selbst die LD-Objektive nicht, wie sie für Kulturflaschen an inversen Mikroskopen verwendet werden. Diese Objektive sind wirklich schwierig handzuhaben. Ich bevorzuge bei diesen hohen NA Immersionsobjektive.

[Lupus]

Hallo Adi,

Wenn man das alles berücksichtigt, wird etwas klarer, warum ich nach der Relation zwischen dem Stacken und dem Deckglas gefragt habe.

ich verstehe nicht was Du damit zum Ausdruck bringen willst, zwischen Einzelbildern und Stacken besteht kein Unterschied. Es wurde schon erwähnt dass Stacken nichts an der Unschärfe verändert, die durch eine Fehlanpassung des Deckglases bzw. des Einschlussmittels bei Objektiven hoher NA entsteht. Solange die gesamte Stacktiefe aber noch innerhalb der Fehlertoleranz des Objektives für falsche Anpassung des Mediums zwischen Objektiv und Objekt liegt, ist alles in Ordnung.

Das Thema Deckglasdicke wurde hier schon wiederholt diskutiert, und u.a. erwähnt dass ganz grob gesagt bei einer NA=0.40-0.45 eine falsche Kombination Objektiv-Deckglas störend sichtbar wird. Natürlich hängt das auch von der Anpassung der Kamera an die Objektivauflösung ab, das muss ich sicher nicht erwähnen. Die zulässige Abweichung vom optimalen Wert der Deckglasdicke reduziert sich etwa mit der 4. Potenz der NA des Objektives, das Bild wird also ab einen bestimmten Wert sprunghaft schlechter. Ich hatte das hier https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35840.msg262378#msg262378 auch einmal an zwei gerechneten Beispielen demonstriert (erste Reihe Vergleich ohne-mit Deckglas 0.17 mm, zweite Reihe Vergleich Fehlanpassung 0.02 mm). Ähnliches gilt natürlich auch wenn das Medium hinter dem Deckglas vergleichbar dick ist oder einen falschen Brechungsindex besitzt.

Hubert

[Lupus]

Hallo Adi,

ich weiß wie Stacken funktioniert.   Ich habe mich natürlich auf das "Deckglasproblem" bezogen, da besteht kein Unterschied zwischen Einzelbildern und Stacken. Ein Stapel unscharfer Bilder bleibt auch nach dem Stacken unscharf. Es genügt also, das Problem für jedes Einzelbild aus dem Stack zu betrachten. Und da wurde in den früheren Diskussionen zu dem Thema Deckglasdicke doch das Wesentliche erläutert.

Hubert

[Nochnmikroskop]

Hallo ADi,

Du suchtest Bilder, die die Zusammenhänge zeigen.
Aus der Suche nach "Deckglasdicke" begrenzt auf die letzten 999 Tage, sind sehr gute Treffer dabei, die das von mehreren Seiten erläutern.

Hier, https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=38335.msg282092#msg282092, sind auch schöne Vergleichsbilder eines Testobjektes mit und ohne Deckglas.
oder hier https://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/immersion.html  viel Info, auch bei den Treffern gefunden

Wie schon Hubert schrieb bleibt ein unscharfes Einzelbild auch im Stack unscharf, somit der gesamte Stack.
Ich übersetze das für mich mal so:
Ich brauche eine Brille mit Korrektur meiner Sehschwäche (z.B. Hornhautverkrümmung, Astigmatismus).
Wenn ich keine Brille nehmen möchte, dann sehe ich alles verschwommen, egal wie nah oder wie weit ich weg bin.
Nehme ich die falsche Brillenstärke kann ich immer noch nicht scharf sehen auch wenn die super vergrößern kann und bei meinem Bruder bestens funktioniert.

In wieweit Dir eine Dekonvolution Funktion helfen könnte kannst Du ja mal probieren und uns zeigen. Ich meine die Planeten-Fotografen machen das. 
Du bist ja sehr experimentierfreudig, probiere es mal an der Klaue , oder einer tiefer liegenden Struktur aus, wäre sicherlich interessant. Vielleicht erfindest Du damit das Rad neu? (ernst gemeinter Vorschlag)

Das eingedeckte Insekt hat vermutlich mind. 3 Fakten, um die man nicht herumkommt.
1. Die Stacktiefe um alles erkennen zu können beträgt 2 mm + unbekannte Deckglasdicke >>> das geht nur mit Arbeitsabstand von >2mm besser 3 mm, also bei hoher n.a. nur mit den schon vorgeschlagenen Wasserimmersionsobjektiven, die kommen bis zu 3 mm tief.
2. Das Deckglas hat wohl eine n.a. von ca. 1,515 >>>  da geht definitiv nix mit Objektiven ohne DG-Korrektur, s.o. >>> also idealerweise eines mit einstellbarer Korrektur verwenden.
3. Das Medium in dem der Käfer eingebettet ist, ist Dir unbekannt. Auch hier kann kein Trockenobjektiv hoher n.a. klar durchsehen.
Alles nichts neues

LG Frank