Fluoreszenzfärbung von Ciliaten

[Ralf Feller]

Liebe Kollegen,
angeregt durch die Arbeiten von Thilo Bauer habe ich nun auch einmal Ciliaten
aus einem Heuaufguss fluorochromiert. Beobachtet habe ich dabei hauptsächlich
Paramecien. Fluoreszenzfarben waren Acridinorange (AO) und Rhodamin B (RB)
In Volvic pH 7.2 in einer von Thilo beschriebenen Konzentration:
10mg auf 50ml Volvic, davon 100µl auf 10ml Volvic.
Fluoreszenz 450/510/Lp520 am Standard WL mit CoolPix 990.
Abb. 1 bis 3 zeigt eine AO Färbung (1Tr. Farblösung + 1Tr. Kultur).


Abb.1

Abb.2

Abb.3

Der Makronucleus ist schön sichtbar, die Anfärbung des Kerns verschwindet
aber innerhalb einer Beobachtungszeit von 30 min. während die übrige
Fluoreszenz erhalten bleibt. Dies lässt sich verhindern wenn man die
Farblösung leicht alkalisch macht. Auch bei einer Simultanfärbung von AO und RB
bleibt die grüne AO Fluoreszenz erhalten. Es sollte sich also nicht um einen
Ausbleicheffekt handeln. Denkbar sind für mich eine Stabilisierung des Kerns oder
eine Verhinderung einer Umspeicherung von AO durch RB.
Rhodamin B führt zu einer intensiven Rotfärbung unter Aussparung des Zellkerns,

Abb.4

Abb. 5 zeigt eine Doppelfärbung von AO und RB.


Abb.5

Abb. 6, 7 und 8 sind reine Bildbearbeitung von Abb.5:

Abb.6

Abb.7

Abb.8

Abb.6 in Photoshop rot ausgeblendet
Abb.7 in Photoshop grün ausgeblendet, wobei die grüne Kernfarbe sich
nicht reduzieren ließ (??).
In Abb.8 habe ich mit Picolay die Bilder 6 und 7 kombiniert.

Dabei zeigt sich das die Bindungsstellen der beiden Farbstoffe in Zytoplasma
weitgehend identisch sind bis auf wenige Stellen wo grün und rot getrennt sind.

Abb.9 zeigt einen anderen Ciliaten in der AO Färbung, ich fand das Bild so schön
und habe mich gewundert das keine Organellen angefärbt werden.

Abb.9

LG Ralf

[Aljoscha]

Hallo Ralf,

schöne Arbeit!
Die Farbstoffkonzentrationen, mit denen man da arbeitet sind ja wirklich homöopathisch.

Viele Grüße

Alexander

[Peter Reil]

Hallo Ralf,

das ist einer der Momente, wo ich gerne den "Like-Button" dürcken würde.

Schöne Aufnahmen - danke für's Zeigen!

Gruß
Peter

[SNoK]

Lieber Ralf,

Ciliaten im Weltraum, sehr schön anzuschauen. Sowas kann ich mit meiner Ausrüstung nicht.

Grüße
Stephan

[Bernd]

Hallo Ralf,

das letzte Foto finde ich besonders interessant, weil sonst wahrscheinlich nicht so gut sichtbare Strukturen deutlich sichtbar gemacht werden. Weißt du, was das für ein Ciliat war und warum die Oberflächenstrukturen so gut angefärbt wurden?

Viele Grüße
Bernd

[Ralf Feller]

Lieber Bernd,
ich habe leider nicht parallel im Durchlicht beobachtet,
nach dem was ich im DIC gefunden habe könnte es Blepharisma sein.

LG Ralf

Ps. Ich habe Thilo mal angemailt, er hat am meisten Ahnung denke ich.

[TSchöll]

Hallo Ralf,
sehr beeindruckende Bilder! Wie lange muss man denn dafür belichten und halten die Ciliaten solange überhaupt still?
Grüße
Till

[Ralf Feller]

@Bernd: Ich hatte inzwischen regen Kontakt mit Thilo,
ein Blepharisma ist es jedoch nicht.
Ohne gleichzeitiges Hellfeld kann man schlecht eine Bestimmung durchführen.

@Till: Die Belichtungszeit war 1/4 sec. Man braucht viel Geduld bis sich ein Ciliat niederlässt.

Erstaunlicherweise ist die nun über 20 Jahre alte CoolPix 990 so lichtunepfindlich, das man
das Monitorbild auch auf die Speicherkarte bekommt.
Ich arbeite sonst mit eine Eos 700D und PC, da muss ich nach dem Foccusieren aber die
Belichtungzeit so weit herabsetzen, dass der Monitor schwarz wird, sonst ist das Bild völlig
überstrahlt. Gibt es für die Eos eine spez. Einstellung mit der Fluoreszenz gut funktioniert?

LG Ralf

[Ralf Feller]

Liebe Kollegen,
bei weiterer Beobachtung konnte ich noch einige Paramecien die
offensichtlich Grünalgen gefressen hatten durch die rote Eigenfluoreszenz
finden. Diese ließen sich auch schön im DIC wieder finden.





Dann wahren da noch etliche Rädertierchen die als Vielzeller ein
ganz anderes Fluoreszenzbild zeigten. Da scheinen mir die einzelnen
Zellkerne angefärbt zu sein.




LG Ralf

[Aljoscha]

Hallo Ralf,

Stark! Wie motivierst Du die Viecher, stillzuhalten?

Viele Grüße

Alexander