Botanik: zerrissene Schnitte

Orkim · April 07, 2023, 15:27:55 NACHMITTAGS

Werte Forenkollegen und -kolleginnen,

ich habe ein Problem mit meinen Schnitten vom Efeu. Sie sind ausnahmslos innerlich zerrissen - und ich auch bald

Zum Arbeitsablauf: ich schneide Blatt mit Stiel frisch und konserviere den Stiel sofort in AFe. Das kleine ,,e" ist Absicht: ich habe nämlich keinen Eisessig, sondern nur Essigessenz 25 % ig zur Verfügung. Davon gab´s dann etwas mehr in den Ansatz. Die Probe blieb 1-2 Tage im AFE, wurde dann mit Ethanol 70 %ig gespült und mit meinen Möglichkeiten und mit Ethanol 70 %geschnitten. Das bedeutet:

mit Möhre im Zylindermikrotom und Bobs Klingenhalter mit frischer OLFA-Klinge
mit Bobs Klingenhalter und einer nach Augenmass eingeklemmten Roundfin 1601 B
im HAGA Tischmikrotom und frischer Rasierklinge, ebenfalls teilweise zur Stabilisierung mit Möhre eingefasst

Die Schnitte sind über 70 % Ethanol / 50 % Ethanol / 30 % Ethanol in destilliertes Wasser verbracht worden. Ich halte mich da an die Zeiten in der Anleitung des MKB und arbeite behutsam im Uhrglas, um die Schnitte mechanisch so wenig wie möglich durch Manipulationen mit dem Pinsel zu belasten. Ich habe in Etzold konzentriert gefärbt, ich habe mit Etzold Schnellfärbungen durchgeführt (ca. 40 Sekunden auf dem OT, 1 x Erwärmen), ich habe langsame 24 Stunden Färbungen in Wasser durchgeführt. Die verwendete Chemie ist frisch vom Fachhandel. Ich habe ebenfalls frische Schnitte zur Härtung 48 Stunden in 70 % Ethanol liegen lassen vor der Färbung. Ich habe auch mal bewußt dicker geschnitten und überfärbt (s. Bild im Anhang).
Das Ergebnis ist jedoch jedesmal das gleiche: Risse im Schnitt. Unter dem Stereomikroskop erkenne ich beim Färbevorgang in Wasser, wie sich die Schnitte sphärisch verformt haben und im Bereich von Mark- und Rindengewebe zerrissen sind. Allerdings: gut die Hälfte aller Schnitte zeigte diese Defekte bereits beim Schnitt und wurde dann schon unter dem SteMi aussortiert. Und nun möchte ich gerne die berufeneren Schnippler um Hilfe bitten. Woran liegt das und was muss ich tun um (endlich) einmal einen vorzeigbaren Schnitt einbetten und als ,,Nr. 1" in meinen Präparaterkasten einsortieren zu können? Gibt es bessere Jahreszeiten mit stabilerer Struktur für botanische Schnitte? Habe ich einen systematischen Fehler im Arbeitsablauf? Warum ist das Mark des Efeu so weich?
Ich danke euch schon mal für Hinweise, die mein Arbeiten verbessern können. Wo kann ich ansetzen?

Gruß, Peter

knipser009 · April 07, 2023, 15:48:10 NACHMITTAGS

Hallo Peter

Mindestens 100 Pflanzen habe ich schon geschnitten. Trotzdem habe ich auch heute noch ca 50% Ausschuss. Du befindest Dich also in guter Gesellschaft.

Deine Vorbereitung scheint mir korrekt zu sein. Ich gehe davon aus, dass Du einen ziehenden und nicht drückenden Schnitt machst.

Wutsdorff Peter · April 07, 2023, 17:23:30 NACHMITTAGS

Guten Abend Namensvetter,
in den ersten beiden Bildern sehe ich keine Risse.
Aber, mir geht es oft auch so wie Dir.
M.E. hängt das von der Probe ab, d.h. davon, was Du schneidest.
Mit dem HAGA habe ich schlechte Erfahrung gemacht und mich von ihm getrennt.
Ich bin auch ein Anfänger, trösten kann ich Dich nicht.
Wie der Berliner sagt: "Mit die Doofen is Jott" oder : ein blindes Huhn findet auch ein Korn. : Meine Schnitte von der Weymuth-Kiefer fanden Anklang im Forum.
Du kannst sie Dir im Forum ansehen: Kapitel: Fotos
Gruß Peter

Noch was, selbst wenn ich Eulen nach Athen trage:
Feuchtest Du die Probe unmittelbar vor´m Schneiden, sowie die Schneide des Messers mit 70% Ethanol an?
Gruß Peter

liftboy · April 07, 2023, 17:29:11 NACHMITTAGS

Hallo Peter,

nur um Dich zu trösten:
Ich schneide mit dem Jung-Schlittenmikrotom (wobei mir B und C Messer zur Verfügung stehen). Ich hab versucht einen frischen Fliederzweig zu schneiden. Bis das richtig funktioniert hat, 90% Ausschuß; das hab ich dann, als ich den Bogen aushatte auf 50% drücken können. Eventuell melden sich noch die Spezialisten (Jörg, Hans-Joachim, etc.) zu Wort. ich häng mal Bilder vom Flieder dran (ist die Stelle, die eine Knospe bildet).

Grüße
Wolfgang

Edit: Bilder angehängt

Orkim · April 08, 2023, 12:59:17 NACHMITTAGS

Hallo zusammen,
hallo Wolfgang "liftboy" (schön, von dir zu hören!)

@Wolfgang knipser009: der Hinweis mit dem ziehenden Schnitt ist absolut berechtigt, danke dafür! Ich habe x-mal die Anleitung von Jörg ("Fahrenheit") gelesen – und natürlich bei meinen Schnitten immer schön von mir weg geschnitten, also alles andere als "ziehende" Schnitte gemacht. Das werde ich ausprobieren.

@Peter: nun, im ersten Bild sind deutliche Risse im Rindenparenchym zu sehen. Ob das mit dem HAGA gemacht ist, weiß ich nicht, sie treten bei allen Schneidemethoden auf. Allerdings: mit dem HAGA komme ich nach einigen Anpassungen (großer Magnet und einer Einlage von 10 mm Ø PTFE Rundstab für den Probenhalter) und der entspr. Technik (von unten etwas gegenhalten beim Schneiden) sehr gut klar, es ist meine bevorzugte Methode.

@liftboy: Wolfgang, du hast´s gut! Du hast ja ein Mikrotom. Und daher: wenn´s schief geht, dann ist halt das Ding dran schuld

Womit hast du denn den Flieder so prominent gefärbt?

Okay, ich stelle also fest: erst mal kein systematischer Fehler bei meinem Vorgehen. Also: weitermachen. Mir kommt nur gerade Einsteins berühmtes Zitat in den Sinn:

Zitat,,Die Definition von Wahnsinn ist: immer wieder das Gleiche zu tun und andere Ergebnisse
zu erwarten."

Von daher frage ich mich schon, warum die Resultate in Zukunft anders werden sollten, wenn ich nichts an meinem Arbeitsprozess verändere. Ich hoffe also noch auf Tipps von erfahreneren Schnittern

Grüße aus OWL,
Peter

spectator · April 08, 2023, 14:17:16 NACHMITTAGS

Hallo Orkim,

wie Du beschrieben hast, wölben sich die Schnitte beim Einbringen in das AFe bzw. in die Alkoholstufen. Das ist eine bekannte Erscheinung, die durch die verschiedenen Oberflächenspannungen der Flüssigkeiten hervorgerufen werden und die am Ende zu radialen Einrissen in die nun schüsselförmigen Schnitte führt. Erkennen lassen sich die Unterschiede der Oberflächenspannung daran, daß die Schnitte "tanzen", wenn sie von einer Flüssigkeit in die nächste gebracht werde.
Dieser Effekt läßt sich reduzieren durch Einsatz eines Netzmittels. Ich setze mir dazu einen Liter "Verdünnungswasser" an, indem ich zum Aqua dest. einige Tropfen eines Tensids gebe, im einfachsten Fall ein (möglichst wenig parfümiertes) Spülmittel. Mit diesem Wasser setze ich dann die verschiedenen Alkoholstufen an und gebe auch einen Tropfen Tensid ins AFE.

Eine weitere mögliche Ursache für das Reißen der Schnitte ist die Osmose. Die Zellen des Schnittes enthalten ja Plasma, also eine (z.T. kolloidale) Lösung verschiedenster Stoffe. Bringen wir nun den Schnitt in eine salzfreie Flüssigkeit (Aqua dest.!), so nehmen die Zellen Flüssigkeit auf und dehnen sich aus. Nun ist es freilich so, daß nicht alle Zellen sich in gleichem Maße ausdehnen: die "weicheren" Zellen im Inneren das Schnitts dehnen sich stärker aus als die "härtere" Rinde.
Hier wäre eine Möglichkeit, dem Ansetzwasser eine geringe Menge Salz oder auch Zucker zuzugeben, so daß der osmotische Druck ausgeglichen wird (Menge ausprobieren, je nach geschnittener Probe).

Zum AFE: Es gibt ja nicht nur eine Angabe zur Zusammensetzung des Fixiermittels.
Eine davon lautet: Alkohol 70% 90Teile ; Formaldehyd 37% 5Teile ; Essigsäure 100% 5Teile
Mein Formaldehyd hat 20% --> bessere Lagerfähigkeit, und meine Essigsäure ist 20%ige Essigessenz
Daher ist mein Rezept: Alkohol 96% 65Teile ; Formaldehyd20% 10Teile ; Essigessenz 20% 25Teile

Viele Grüße

Helmut

liftboy · April 08, 2023, 16:25:49 NACHMITTAGS

Hallo Peter,

gefärbt wurde mit FSA:
Fuchsin-Safranin-Astrablau nach Etzold (Schlüter, S. 279)
Rezept auf Anfrage, falls das Buch nicht vorliegt.

Grüße vom "Schnitter"

Nochnmikroskop · April 08, 2023, 20:35:17 NACHMITTAGS

Hallo Peter,

den Hinweis von Wolfgang hast Du ja gelesen.

Zitat von: knipser009 in April 07, 2023, 15:48:10 NACHMITTAGS
....
Ich gehe davon aus, dass Du einen ziehenden und nicht drückenden Schnitt machst.

Aber kennst Du auch die Bedeutung des ziehenden Schnittes?

Zitat von: Orkim in April 08, 2023, 12:59:17 NACHMITTAGS

.... und natürlich bei meinen Schnitten immer schön von mir weg geschnitten, also alles andere als "ziehende" Schnitte gemacht. Das werde ich ausprobieren.

Beim ziehenden Schnitt wird die Schneide schräg zugeführt. Man braucht also etwas mehr Schneidenlänge zum Durchtrennen der Probe, als bei dem geraden, drückenden Schnitt.
Vergl. https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=8959.msg62986#msg62986 Bild 12 von Hans-Jürgen.

Die Richtung in der der Schnitt erfolgt, vom Körper weg, oder zu Dir hin, hat keinen nennenswerten Einfluss. Beim Zug zum Körper hin kannst Du immer den Schnitt sehen, aber als alter Tischler sage ich immer vom Körper weg.

LG Frank