Spirogyra, wo sind deine Zellkerne, Teil 2

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
neuer Versuch. Ein liebes Forenmitglied hat mir freundlicherweise eine Probe DAPI zukommen lassen. Damit habe ich heute angefangen, zu experimentieren.

Ich habe ca. 500 µl der Algenprobe in einer Küvette mit einem kleinen Tropfen der Lösung versetzt und die Algen nach 5 min, 10 min, 30 min, 60 min und 90 min angesehen. Nun, was soll ich sagen, sieht alles gleich aus.

Zur Technik: Beleuchtet mit einer 3 Watt 365 nm LED, Filterwürfel CZJ 410, leider ohne weitere Bezeichnung (er ist aber sowohl auf Emissions-Seite wie auf Durchlass-Seite mit einem Filtersandwitch versehen, den ich nicht auseinander bauen wollte). Zusätzliche Sperrfilter wurden nicht verwendet. Bei einer Belichtung mit UV-Licht sieht man schon in Sekunden, wie die Autofluoreszenz des Chlorophylls sehr stark abnimmt. Daher hier Belichtung 3 sec bei 400 ASA.

Wie Bild 1 zeigt, sollte sowohl das DAPI funktionieren als auch meine antiquarische Fluoreszenztechnik prinzipiell für DAPI geeignet sein. Nach WIKI liegt das Absorptionsmaximum bei etwa 355 nm und das Emissionsmaximum bei > 450 nm. Sollte also passen.

Bei Bild 3 habe ich etwa auf die Mitte der Spirale fokussiert, da dort irgendwo der Zellkern sein sollte. Aber, wie man sieht, sieht man nix.
Selbst wenn ich im Durchlicht den Zellkern sehe, finde ich beim Umschalten auf Auflicht-Fluoreszenz kein noch so kleines blaues Fünklein.
Was mache ich da falsch?
Schönen Abend,
Carsten

[Bernd]

Hallo Carsten,

dein Fehler ist, dass du versuchst lebende Zellen zu färben. Und dann auch noch die von Gallerthüllen umgebenen Spirogyra. Standardprotokolle für DAPI-Färbung umfassen fixieren, permeabilisieren und dann färben. Vielleicht geht es nach Zugabe von 1 - 2% DMSO und lange Inkubationszeit. Hast du schon mal im Internet nach Protokollen gesucht?

Viele Grüße
Bernd

[Carsten Wieczorrek]

Hallo Bernd,
so etwas habe ich befürchtet. Könnte Triton X100 helfen?
Carsten