Bleaching

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
nach dem nun endlich gestern nach einer sehr langen DHL-Odysse das Ethidiumbromid und eine lebende Volvox-Probe von Spectrum/Holger angekommen ist, musste ich mir das unbedingt ansehen. Leider hatte ich gestern Verpflichtungen und mußte Heute zum Weihnachtsmarkt...
Also ist alles nur schnell zusammengemixt. Volvox in Auflichtfluoreszenz.

Färbung: Kombifärbung Ethidiumbromid/Acridinorange. Hatte leider nur 20 Minuten Zeit zum Färben. Diese Färbung habe ich noch um eine Kleinigkeit Coryphosphin erweitert. Warum? Coryphosphin färbt die DNA/Kerne nicht so, wie die anderen beiden Farbstoffe. Dafür färbt es andere Zellbestandteile. Meine Hoffnung war, damit diese Bänder, mit denen die Einzelzellen verbunden sind, zu färben.

Die Aufnahmen sind an meinem Fluoval 2 entstanden mit den Apo 40/0,95. Die Kameraempfindlichkeit stand auf 1000 ASA. Belichtung mit einer 3W 430 nm LED. Filterwürfel CZJ 450 ohne weitere Filter.

Viel Spaß beim Betrachten,
Carsten

Bild 1: ca. 5 sec nach Einschalten der LED, Belichtung 0,2 sec.



Bild 2: ca. 30 sec nach Einschalten der LED, Belichtung 0,4 sec.



Bild 3: ca. 60 sec nach Einschalten der LED, Belichtung 0,4 sec.



Bild 4: ist außer Konkurenz. Belichtung 5 sec. Hier mußte ich kräftig an allen Reglern von Affinity-Photo kurbeln. Das wird wohl meine Wochenend-Aufgabe mit dem 100er.

[Spectrum]

Hallo Carsten,
Was lange währt wird endlich gut.
Schöne Aufnahmen. Auf dem letzten Bild sieht man ja auch schon schön das die Plasmabrücken selektiv angefärbt werden vom AO.
Grüße Holger

[purkinje]

Hallo Carsten,
nur kurz der Hinweis auf die Möglichkeit der Contrast Limited Adaptive Histogram Equalization (CLAHE) als Hilfe für derartige rauschige Bilder:

Beste Grüße Stefan

[Michael L.]

Hallo Stefan,

kannst uns erklären wie man die CLAHE Bildbearbeitungsmethode als Laie anwenden kann? Welche Software?

Gruß

Michael

[Jakob_Wittmann]

Hallo zusammen,

ich möchte mich sicher nicht wichtigmachen, und glaubehoffe, dass Stefan nicht ungehalten sein dürfte, wenn ich die Software für CLAHE erwähne.

Es ist Fiji, eine Distribution von ImageJ.

Bitte lasst Euch durch das unauffällige Bedienfeld im Neunzigerjahre-Look nicht irreführen. Die SW ist enorm mächtig!

https://imagej.net/software/fiji/downloads


LG


Jakob

[purkinje]

Hallo Michael,
wie Jakob schon richtig erkannt hat, habe ich ImageJ /Fiji verwendet; ein Programm welches zur Bidbearbeitung sicher nicht die erste Wahl sein wird. Grundsätzliches zur Methode findet sich
https://imagej.net/plugins/clahe
https://en.wikipedia.org/wiki/Adaptive_histogram_equalization#Contrast_Limited_AHE
Bei einigen Bildverarbeitungsprogrammen finden sich Plugins hierzu, bzw die Möglichkeit Kontraste in hellen und dunklen Bereiche gesondert zu bearbeitenen; Heribert hat das mal für sein picolay hier beschrieben:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=10062.0
Beste Grüße Stefan

[Spectrum]

Hallo,
Nachdem Carsten mich mit seinen Aufnahmen dazu animiert hat auch mal wieder die Leuchtfarben aus dem Chemikalienkühlschrank zu holen, und ein paar Zimmerpflanzen zu ernten, hier ein paar Aufnahmen zum Thema:

Gefärbt wurde mit Hoechst33342 und Acridinorange. Beides ca 0.02% Lösungen. Die Volvox wurden darin für 30min gebadet und ohne spülen gemeinsam mit der Färbelösung auf den Objektträger verbracht. Anregung mit 385nm LED (3Watt) bei 750mA. Anregungsfilter KP490, Iso 3200 1/60sec.
Nachdem das grüne Hintergrundleuchten des umgebenden Mediums bereits nach 1-2 Sekunden "weggebrannt" war (der Lichtfleck des Objektivs hinterlässt nach kurzer Zeit ein regelrechtes  dunkles Loch im anfangs grün schimmernden Wasser) entstand das erste Bild:
Eine Minute später dann das zweite:
Beide Bilder sind,  bis auf das Verkleinern für das Forum und unscharf maskieren, unbearbeitet.

[Spectrum]

Jetzt nocheinmal zwei andere Volvoxkugeln. Einmal mit Sperrfilter 530nm:
Und hier mit Sperrfilter 410nm:

[Michael L.]

Danke Jakob und Stefan für die Erläuterungen!

beste Grüße

Michael

[Spectrum]

Als nächstes wurde mit Uvitex 2B angefärbt. Das bleicht so gut wie gar nicht aus. Spülen mit sauberem Wasser wäre hier sinnvoll. Ausserdem hat es Schwierigkeiten in gesunde Volvoxzellen einzudringen. Ich hab es wohl auch nur wenig verdünnt. In dieser Konzentration wirkt es scheinbar zusammen mit dem UV Licht toxisch. Sobald eine Zelle der Kolonie abgestorben ist wird sie sofort viel stärker angefärbt:
Das führt dann auch zu einer Art Kettenreaktion, in dessen Verlauf die Kugel langsam von einer Seite aus mit Farbstoff durchdrungen wird:

[Spectrum]

Hier ein Zeitraffervideo: