Paraffinschnitt Gänseblümchen

[jcs]

Liebes Forum,

mit Paraffinschnitten habe ich mich schon ein paar Mal versucht, meistens mit begrenztem Erfolg. Die letzten Tage habe ich einen neuen Anlauf genommen, so schön langsam klappen zumindest Einbetten und Schneiden. Als Testobjekt habe ich die leicht verfügbare Blüte des Gänseblümchens herangezogen. Ein paar verwegene Exemplare blühen auch im Februar vor meinem Büro.

Eingebettet wurde über AFE, 100% Ethanol, Methylbenzoat, Xylol, 1:1 Xylol:Paraffin (@50°C), Paraffin (@64°C).

Der Schritt in Xylol und Xylol:Paraffin war jeweils 2h, die restlichen Schritte ungefähr 24h.

Die Paraffinkassetten habe ich vor dem Schneiden am Fensterbrett im Freien auf ca. 4°C abkühlen lassen. Das ist offenbar ein wichtiger Schritt, der die Schnittqualität gegenüber Kassetten bei Raumtemperatur deutlich erhöht. Hier ein kurzes Video vom Schneiden (Schnittdicke 8µm) und Übertragen ins Streckbad:

Die gestreckten Schnitte wurden dann auf Objekträger überführt, die ich mit Eiweiß-Glyzerin beschichtet habe. Danach wurde bei ca. 42°C getrocknet:

In einem zweistufigen Xylol-Bad wurde das Paraffin von den Objektträgern entfernt (erste Stufe bei 37°C, zweite Stufe bei Raumtemperatur). Danach ging es in Isopropanol, 70% Ethanol und Aqua dest. Gefärbt habe ich einmal mit Etzold FCA:



Einen zweiten Schnitt habe ich mit Wacker-Färbung (Acridinrot 5min, Acriflavin 20sec, Astrablau 2min) gefärbt:



Eingedeckt habe ich in Euparal und aufgenommen wurden die beiden obigen Bilder mit einem Leica HC PL Fluotar 20x im Hellfeld.

Soweit bin ich ganz zufrieden, aber 2 Fragen/Probleme habe ich aktuell. Würde mich freuen, wenn da jemand Rat weiß:

(1) Über die Hälfte der Proben ging verloren, da sich beim Entfernen des Paraffins auch die Blütenteile vom Objektträger ablösten. Wie kann ich die Ausbeute diesbezüglich verbessern?
(2) Das Grün bei der Wacker-Färbung ist nicht vorhanden. Generell ist die Färbung etwas stumpf im Vergleich zu Etzold FCA. Was habe ich da falsch gemacht?

LG
Jürgen

[Peter T.]

Hallo Jürgen,

sehr coole Videos. Da beneide ich Dich um Deinen sehr professionell erscheinenden Arbeitsablauf und Deine Ausrüstung.

Die Ergebnisse sind wirklich reizend!

Zum Paraffinproblem kann ich leider nichts beitragen.

Die Färbungen finde ich ehrlich gesagt beide gelungen.

[K. B.]

Hallo Jürgen,

die Schnitte sehen schonmal super aus!
Das Ablösen kann man verhindern, in dem man das Eiweisglycerin vor dem Entparafinieren mit Formoldämpfen härtet oder die Objektträger vor der Nutzung mit Salzsäure, Aceton und Wasser reinigt um evtl. störende Beläge zu entfernen.
Andere Methoden wären z.B. Funktionalisierte Objektträger wie Histobond von Marienfeld, die kann man auch selbst herstellen wenn man an (3-Aminopropyl)trimethoxysilan kommt, da darf man aber dann kein Eiweisglycerin dazwischen machen und man darf nicht die Haftfläche berühren, da sonst die Haftvermittler schon belegt sind.
Wenn sonst nichts hilft kann man auch Chromalaungelatine versuchen, was aber wegen der Abfälle(Sondermüll) und Giftigkeit eher nicht zu empfehlen ist.

Viele Grüße
Kay

[momotaro]

Hallo Jürgen,

Die Schnitte sollten einwandfrei auf gereinigten unbeschichteten Objektträgern haften .

Objektträger mit Ethanol reingen und die Schnitte ohne Klebemittel aufziehen. Die Objektträger zuerst trocknen, erst danach auf die Wärmebank 40° C.

LG Helmut

[jcs]

Hallo Peter, Kay, Helmut,

danke für Eure Rückmeldungen!
@Peter: Freut mich, wenn die Bilder Anklang finden. Das Frühjahr ist ja nicht mehr weit, und hoffentlich kann ich dann einige Blüten unter's Paraffinmesser legen.

@Kay: Danke für die Hinweise. Histobond-Objektträger habe ich eine Schachtel voll, die habe ich heute gemeinsam mit einem Satz gründlich gereinigter Eiweiß-Gelatine-Objektträger ausprobiert. Diesmal habe ich die Objektträger nach dem Herausnehmen aus dem Streckbad deutlich länger trocknen lassen, bei niedriger Temperatur. Das hat bereits deutlich höhere Ausbeuten (>75%) gegeben beim Entfernen des Paraffins. Offenbar muss das Wasser entfernt sein bevor das Xylol das Paraffin auflöst. Ist eigentlich auch nicht überraschend.

@Helmut: Du weist ja auch auf die Wichtigkeit gut getrockneter Objektträger hin, bevor das Paraffin entfernt wird. Das scheint wirklich ein Schlüssel zum Erfolg zu sein. Unbeschichtete Objektträger werde ich auch bei Gelegenheit ausprobieren, das würde die Sache ja deutlich vereinfachen. Schöne Schnittsammlung übrigens, vielleicht zeigst Du uns ja einmal ein paar Mikro-Aufnahmen davon!

LG
Jürgen

[owl capone]

Bei Eiweiß-Gelatine als Kleber kann es schon genügen die Schnitte nach dem Trocknen bei >60°C festzubacken wobei das Eiweiß denaturieren sollte. Weil dabei das Paraffin nochmal flüssig wird müssen die Schnitte aber sicher trocken sein sonst gibt's Murks.

Ich verwende derzeit Gelatine à la Haupt zum festleimen, da brauchts dann doch nochmal etwas chemisches zum Crosslinken. Der Faulheit halber hab ich einfach einen Schluck AFE zur 70% Alkohlstufe zugegeben, seitdem schwimmt nixmehr weg.

Allerdings sind mir wenn dann erst beim Übergang vom wässrigen Alkohl zum reinen Wasser Schnitte flüchtig geworden. Wenn's schon beim entparaffinieren passiert ist Räuchern in Formalindämpfen wohl besser.

LG, Julius

[Alf]

Ich lasse die Schnitte auf Glycerin-Eiweiß Objektträger gut trocknen und nach 24 Stunden kommen die Objekttröger kurz auf die 120°C warme Heizplatte, dabei schmilzt das Paraffin und die Schnitte halten Bombenfest (Schwierigkeiten gibt's nur manchmal bei Insekten).

Lg

[jcs]

Hallo Alf, Julius,

danke für die Hinweise! Offenbar ist eine gute Trocknung der Paraffinschnitte wichtig, merke ich mir. Es ist auch schön zu sehen, dass doch einige hier im Forum Paraffinschnitte machen. Da weiß man, wo man fragen kann.

Inzwischen habe ich eine neue Charge gemacht, mit sauberen Objektträgern, die dann mit Eiweiß-Gelatine bschichtet wurden. Die bessere Trocknung nach dem Aufziehen der Schnitte hat jedenfalls geholfen. Mir kommt vor, dass die Eiweiß-Schicht beim Färben ganz leicht Farbe annimmt, im Fall der Wacker-Färbung vor allem das Acridinrot. Deshalb wäre es fein, wenn das Ganze auch mit unbeschichteten (bzw.Histobond) Objektträgern klappt. Das steht dann als nächstes am Programm.





Vorab aber ein paar Bilder (siehe oben) der letzten Charge (Gänseblümchen-Blüte, 8µm Schnittdicke) mit Eiweiß-Gelatine. Diesmal habe ich bei der Wackerfärbung das Astrablau durch Alcianblau ersetzt. Die Farben gefallen mir jetzt besser. Sieht schon ganz gut aus, finde ich. Das erste Bild zeigt ein Pano aus 4 Aufnahmen mit dem 5x-Objektiv, das zweite ist eine Aufnahme mit dem 10x-Objektiv.

LG
Jürgen

[Peter T.]

Zauberhafte Aufnahmen!

[gewo]

Tolle Ergebnisse. Muss mich wohl auch damit auseinandersetzen, nachdem die Technovit Versuche nicht das gebracht haben, was ich erwartet/erhofft hatte :-) Deine Ergebnisse sind sehr ermutigend.

Ligrü
Gerhard

[jcs]

Hallo Gerhard, Peter,

danke für das Lob!

Ich habe bereits öfters mit dem Schlittenmikrotom Paraffinschnitte versucht, das war immer extrem mühsam und wenig reproduzierbar: Die Schnittdicke variierte stark, und die Schnitte rollten sich extrem ein. Mit dem Rotationsmikrotom ist das eine ganz andere Liga: Durch die Schnittbänder ist Einrollen weniger ein Thema, und die jeweiligen Schnitte haben sehr zuverlässig immer dieselbe Dicke. So sind Schnitte zwischen 5 und 10µm recht einfach machbar, ideal für die Mikroskopie von Blüten.

Technovit ist sicher deutlich komplizierter, dafür kann man dort härtere Gewebe schneiden und noch dünner werden. Aber wenn man das nicht benötigt, ist Paraffin angenehmer in der Handhabung.

LG
Jürgen

[Alf]

Lieber Jürgen,

teilweise habe ich mit dem "Flambieren" von Objektträgern gute Erfahrung gemacht, OT mit einer Pinzette in der rauschenden Bunsenbrenner Flamme erhitzt (so werden sie vollkommen sauber uns die Haftung verbessert sich). Man muss die OT dafür jedoch sehr sehr gleichmäßig durch die Flamme hin und herbewegen und sie im Anschluss vorsichtig in der Luft abkühlen lassen sonst zerspringen sie. Versuchs mal, mit etwas Übung klappt das gut. Berühre mal einen so hergestellten abgekühlt OT, man haftet mit dem Finger viel besser.

Lg

[jcs]

Hallo Alf,

"Flambieren" klingt gut, kommt auf die Versuchsliste.
LG
Jürgen

[Rawfoto]

Hallo Jürgen

Das ist wirklich gut geworden, das Aufheizen der Schnitte beim Aufbringen auf den Objektträger ist der Schlüssel. Ich reinige im letzten Schritt mit der Feuerzeugflamme ( nicht bis zur Verfärbung von Glas, das reicht). Dann ISO um möglichen Ruß weg zu bekommen.

Beim nächsten Mal probieren wir das gleiche mit Technovit, hoffe das es in Weinberg schon welche gibt.

@Gerhard, aufgeben ist keine Option, wir sind schon sehr weit und ich gehe davon aus den Rest auch noch zu schaffen👍
Liebe Grüße
Gerhard

[jcs]

Mittlerweile ist die Erfolgsquote bei der Herstellung der Paraffinschnitte deutlich gestiegen. Am besten hat folgende Vorgangsweise funktioniert:
(1) Beschichten der Objektträger mit Eiweiß-Glyzerin
(2) Wärmen der Objektträger auf 45°C
(3) Herausfischen der Schnitte aus dem Wasserbad (45°C)
(4) 24h Trocknen der Schnitte auf dem Objektträger
(5) Aufheizen der Objektträger auf 45-50°C, sodass das Paraffin der Schnitte noch nicht schmilzt
(6) Erste Xylolstufe mit vorgewärmten Xylol (35-40°C) zr Entfernung des Paraffins
(7) die nächsten Schritte dann bei Raumtemperatur (Xylol II --> Isopropanol --> Ethanol 70% --> Wasser --> Färben)

Mit dem Protokoll hatte ich fast 100% Erfolgsquote. Hier zwei Beispiele, leider ist das Motiv etwas langweilig (Querschnitt der Blüte des Wald-Gelbsterns), aber es geht in dem Fall mehr um die Vorgangsweise.

Einmal habe ich mit Wacker (Acridinrot, Acriflavin, Alcianblau) gefärbt, einmal mit Hamburger Grün (Neufuchsin, Chrysoidin, Alcianblau, Titangelb). Damit es nicht zu langweilig wird, noch eine REM-Aufnahme eines Pollenkorns des Wald-Gelbsterns, die wir beim MGW-Netzwerktreffen am 25.3. erstellt haben.

Wacker-Färbung


Hamburger Grün


REM Aufnahme