Brechungsindex von Immersionsölen mit geringer Eigenfluoreszenz

[Aljoscha]

Hallo,

Sucht man nach Immersionsöl für die Fluoreszenz-Mikroskopie, stolpert man immer wieder über Öle mit einem Brechungsindex zwischen 1.479 und 1.482 (589 nm). Die gibt es sogar von hochangesehenen Herstellern wie Cargille.

Da frage ich mich, warum ich nicht einfach preiswerte, wasserlösliches Glycerin nehme?
Was ist der Sinn dieser Immersionsöle?

Viele Grüße

Alexander

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Alexander,

ich hab keine Ahnung, aber ich hab das Gefühl, dass sich Öle leichter abwischen lassen als das ziemlich klebrige Glycerin.

lg Daniel

[jochen53]

Der Brechungsindex eines Immersionsöls muß zur Rechnung des Objektivs passen. Glyzerin kann man nur verwenden, wenn das Objektiv dafür auch gerechnet ist (sog. Glyzerinimmersionen). Der Brechungsindex für "normale" Immersionsöle und die Abbé-Zahl sind sogar genormt. Die o.g. Brechzahlen um die 1,48 deuten darauf hin, daß es vermutlich ganz normale aromatenfreie Paraffinöle (paraffinum liquidum) sind.
Ich glaube, es gibt einen Zusammenhang zwischen der erreichbaren Apertur und der Brechzahl des Zwischenmediums. Es gibt/gab sogar mal Monobromnaphthalin-Immersionsobjektive. Hohe Brechungsindices sind nur mit Aromaten (z.B Phthalate) und/oder Halogen-Substituenten realisierbar (z.B. PCB, Chlorparaffine) und Aromaten können fluoreszieren. 
Viele Grüße, Jochen

[Aljoscha]

Hallo Jochen,

Es gibt ja für Fluoreszenz geeignete Öle mit Brechungsindex von 1.51x, wie das 518F von Zeiss. Das geht also offenkundig.

Unklar ist mir, welchen Zweck Öle haben, deren Brechungsindex sich kaum von Glycerin unterscheidet.

Viele Grüße

Alexander

[jochen53]

Da ich im Ruhestand keinen Zugriff mehr auf ein Abbè-Refraktometer habe, kann ich leider die Abbè-Zahlen von Flüssigkeiten nicht mehr messen, vielleicht ist das der Grund. Die Brechzahl von Glyzerin ist nicht konstant, weil Glyzerin hygroskopisch ist und dadurch sinkt der Brechungsindex stetig. Ich hab mal vor vielen Jahren in einem Fachgeschäft, die damals u.a. Zeiss-Mikroskope und Zubehör verkauft haben, ein kleines Fläschchen Immersionsöl gekauft, namenlos, ohne Herstellerangabe, ohne Brechzahlangabe. Laut IR-Spektrum und gemessenem Brechungsindex war das lediglich Paraffinöl. Für den Preis hätte ich sicher fast einen ganzen Liter bekommen können (in der Firma hatten wir 15.000 Liter davon im Tank). Ich habs denen mit dem IR-Spektrum zurückgebracht und sie haben mir als Ersatz ein Fläschchen Zeiss 518 N gegeben. Dessen Plastikfläschchen ist nach ein paar Jahren spröde und brüchig geworden und ist im Schrank ausgelaufen, eine Riesen Sauerei.
Viele Grüße, Jochen

[Silber_und_Licht]

Moin!

Ein Immersionsmedium welches sich significant vom Brechungsindex des Deckglases unterscheidet kostet Licht.

Maßgebend für das Quantum emittierten Lichtes ist das Anregungslicht und eben dieses anregende Licht ist meist kurzwellig und damit energiereich und für Untersuchungen an lebenden Zellen von Übel. Die Zellen leiden darunter, stellen ihre Aktivität sehr schnell ein und sterben wenn die eingestrahlte Lichtmenge zu stark wird. Folglich muss man die der Probe emittierten Photonen möglichst effektiv einfangen und auswerten. Kurze Strahlengänge, stark verbesserte Vergütungen und eben Immersions- (und Einbett- !) Medien sind Voraussetzungen um moderne, hochauflösende Fluoreszenz- und Konfokal-Mikroskopie effektiv betreiben zu können.

Ein in dieser Hinsicht spürbarer Fortschritt wurde z.B. hiermit erzielt:
Invitrogen™ ProLong™ Glass Eindeckmittel

Das Mittel ist auf den ersten (und 2. bis 12.) Blick sauteuer. Aber man geht damit äußerst sparsam um, appliziert mit einer Mikroliter-Pipette und erfreut sich an den exzellenten Ergebnissen. Es zahlt sich nicht nur in gesteigerter Helligkeit, sondern damit auch in gesteigerter Auflösung und in der Dauerhaftigkeit/Haltbarkeit der Präparate aus.

Vergleichbares gilt auch für die Immersionsöle, welche nicht nur teuer, sondern in ihren optischen Eigenschaften auch abgestimmt sind auf die Objektive des Herstellers und bei höchstauflösenden Objektiven auch auf die jeweilige Arbeitstemperatur. Die Objektive am oberen Ende der Leistungskette haben trotzdem sie Immersionobjektive sind, eine Korrekturfassung für die Arbeitstemperatur auf dem Mikroskoptisch. Es ist ein sichtbarer Unterschied in der Bildqualität, ob diese Objektive bei 23°C oder 30°C oder 37°C benutzt werden und es ist absolut kontraproduktiv, erst Objektive der obersten Preisklasse anzuschaffen um dann bei deren Anwendung beim Immersionsmittel zu sparen.

Allerdings darf es für die Anwendung von Immersionsmitteln sicher einen Unterschied machen ob ich mir die Primär-(Auto-)fluoreszenz des Chlorophylls eines Handschnittes durch die Nadel von pinus nigra ansehen will oder zellbiologische Forschungen an mit Viren infizierten Einzelzell-Präparaten anstellen möchte.

Freundliche Grüße
Wolfgang

p.s.: Glycerin ist ein mehrwertiger Alkohol und lässt sich daher wunderbar mit etwas Linsenputzpapier, angefeuchtet mit ein/zwei Tropfen destillierten Wassers vom Objektiv wischen.