Azan - Färbung, 3D, Tiefenstruktur

[rlu]

Hallo,

erster Versuch mit Azan-Färbung, vielleicht etwas überfärbt.
Ösophagus Kaninchen
Bindegewebe, Kollagen werden blau angefärbt, Muskelfaser, Kerne, Zytoplasma rot.
Interessant, dass die dünnen Schnitte eine Tiefenstruktur haben, sichtbar in 3D.

Ablauf
Entparaffinieren mit Xylol.
Hinweis: ich verwende 2 Behälter a 15ml. Der erste wird nach Gebrauch im Sammelbehälter geleert. Der zweite wird zum ersten. Der zweite wird wieder aufgefüllt. Zeit je Behälter 5min.  Sichtkontrolle.
Wird das nicht so gemacht, bleiben Restspuren. Evlt. würde das mit Erwärmen und Schütteln noch besser gehen.
Nicht getestet.
Alkoholstufe abwärts=ins Wasser bringen, ISO, 96, 70, 50, 30, Aqua dest

Azocarmin-G-Lösung = Kernechtlösung? 30min
Orange-G-Lösung = Wolframphosphorsäure 30min
Anilinblau-Orange G-Lösung 5min
dazwischen immer mit Aqua dest spülen

3 x ISO, entwässern
2 x Xylol, Zwischenmedium für das Harz
Malinol

Sicherheit:
Handschuhe
Brille
Wegwerfpipetten + Behälter
Glasplatte
Ständer für Fläschen!!!, damit nichts umfällt
Färbebank
Papier

Gefühlt etwas überfärbt. Die Frage ist wie kann man das verbessern?
Färbezeiten von Anilinblau-Orange G-Lösung verkürzen?

Man soll ja zum Differenzieren nach Azokarmin Anilinalkohol nehmen, das lasse ich.
Als letzten Schritt habe ich 96% Alkohol zum differenzieren verwendet so bei bei Aisner beschrieben. da hat sich aber nur wenig getan.(nach Aisner/Azan Heidenhain)
http://www.aeisner.de/methoden/farb2.html

Die Bilder schauen etwas verschwommen aus, werden aber glasklar, wenn man den Kreuzblick kann.
Und damit wird auch die Tiefenstruktur sichtbar.
Als Großbild anschauen.

Liebe Grüße
Rudolf




ohne 3D

[rlu]

Hallo,

hier noch eine Übersicht:




Ausschnitte




Liebe Grüße
Rudolf

[rlu]

Hallo,

Überfärbung: Eigentlich hätte es durchgehend so aussehen müssen.
In der Übersicht ist zu erkennen, dass ein großer Teil der Muskelzellen blau statt rot gefärbt ist.





Liebe Grüße
Rudolf

P.S, noch folgendes gefunden
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=94458
Florian Stellmacher schreibt:

die originale AZAN-Färbung nach Haidhein setzt Azokarmin-Essigsäure und Anilinblau-Orange-Eisessig ein, und das gibt oft auch gute Ergbnisse. Ich habe festgestellt, dass die Färbung an BOUIN-fixiertem Gewebe dann hervorragend funktioniert, wenn die Schnitte schön dünn sind, bei dickeren Schnitten überfärbt das Anilinblau aber recht schnell, dann ist das Ergebnis knallblau und somit nicht zu gebrauchen.

[Rawfoto]

Hallo Rudolf
Zu: Überfärbung, ja, so bunt habe ich das noch nicht gesehen .-)

Durch Verkürzung der Färbezeit oder durch Verdünnung der Färbelösung kannst du die Färbung steuern, ich persönlich ziehe die Verdünnung vor, das ist aber eine Frage wie viel Zeit man hat. Im professionellen Bereich kommt es natürlich auf die Färbezeit an. Dort wird die Färbezeit verkürzt.

Liebe Grüße
Gerhard

[Jürgen H.]

Lieber Rudolf,

nach der Azokarminfärbung müsste die Farbe so weit differenziert werden, dass die Zellkerne aus der Farbe deutlich hervortreten. Lt Rezept geschieht das mit einer kurzen Wässerung in a.d. und anschließenden Differenzierung in Anilinalkohol, wobei Du Dir über die Giftigkeit des Anilins ja schon im Klaren bist. (Handschuhe, Entsorgung).Die restliche Differenzierung erfolgt dann in der Phosphorwolframsäure.
Auch der viel zu starke Blauton müsste differenziert werden. Das mache ich nicht in Alkohol, sondern in 90 % Iso, das geht etwas langsamer und kontrollierter als mit dem im Rezept angegeben 90% Alkohol, bedarf aber unbedingt der mikroskopischen Kontrolle, das Blau verschwindet extrem schnell, also wasserhaltiges Iso nur für ein paar Sekunden verwenden. Im Grunde braucht man die Prozente für diesen Schritt nicht ganz genau zu nehmen, nach der Anilinblau Orange Lösung wird ja vor dem Iso in a.d. gewässert. Wenn Du das a.d. abkippst, verbleibt immer ein Wasserrest für das nachfolgende Iso. Nach diesem Schritt sofort in 100% Iso verbringen, zweimal wechseln.dann Xylol etc.

Viel Erfolg!

Jürgen

[rlu]

Hallo Jürgen, hallo Gerhard,

werde eure Tipps beim nächsten Mal berücksichtigen und vielen Dank dafür.

Ich weiß jetzt nicht, ob jeder das sehen kann?
Es handelt sich um 10µm Schnitte, also schon etwas dick für die Histologie.

Was ich faszinierend finde, dass es eine Tiefenstruktur gibt.
D.h. Gewebe liegt nicht zweidimensional vor, sondern baut sich auf.
Manchmal scheint es fast so, als würden die Objekte darin schweben.

Jetzt die Frage, wie kann so etwas überhaupt funktionieren.
Zuerst dachte ich, etwas mit Struktur klebt am Objektträger fest.
Weil der gestreckte Paraffinschnitt die Lage konserviert, bleiben die örtlichen Merkmale erhalten.

Aber es muss da noch eine unsichtbare nicht gefärbte Matrix geben, sonst würde es nicht diese Tiefenstrukturen geben.

Evtl. ist diese Matrix das Zellgerüst, welches dann durch die Fixierung eingefroren wird.
Vielleicht ist das der eigentliche Sinn der Fixierung neben der Konservierung.?!!!

Ösophagus - Histologie 3D


nachgeschärft


Liebe Grüße
Rudolf

[K. B.]

Hallo Rudolf,

bei der Fixierung werden die Proteine miteinander vernetzt und auch zwischen den Zellen/ Zellorganellen gibt es normalerweise "Anhaftungsstrukturen", durch das Entwässern härten die Strukturen auch noch zusätzlich aus, daher bildet sich eine Art schwammiges Gerüst in dem die Zellen und Zellorganellen je nach Schrumpfung ungefähr an ihrem ursprünglichen Platz bleiben.
https://de.wikipedia.org/wiki/Cytoskelett

Viele Grüße
Kay

[rlu]

Hallo Kay,

vielen Dank für die Erklärung.
Ich glaube, das ist ein ganz wichtiger Punkt für die ganze Prozeßkette bei der Paraffin-Einbettung.

DieterS. hat hier noch dazu folgendes in dem Beitrag zur Fixierung geschrieben.
Histologie des Herzens einer Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=389579

Bei einer Fixierung werden die zellulären Strukturen und Organellen mit einem Fixans, im zoologisch-histologischem Bereich in der Regel Formalin oder Glutardialdehyd, vernetzt, so dass ihre Raumanordnungen festgelegt sind und sich auch bei einer anschließenden alkoholischen Entwässerung weitgehend erhalten. Neben dem strukturellen Erhalt ist die Wahl des richtigen Fixans bzw. eine sachgemäße Fixierung auch entscheidend für das histologische Färbeverhalten. Nicht fixierte oder fehlerhaft fixierte Gewebe zeigen häufig ein atypisches Färbebild, dass z.B. an Schnittkanten auftritt, bei denen Sauerstoffkontakt zu lytischen(Zellen bauen sich ab) Veränderungen an den Gewebekanten geführt hat. Bei einer Fixierung ist zu empfehlen, das Fixans vor einer Einlage des Gewebes auf ca. 4 Grad Celsius runter zu kühlen um eine Lyse(wie zuvor) zu vermeiden bzw. zu verringern. Dies gilt besonders für Organe, die einen retikulären Aufbau (Organe des Fisches, Milz der Maus, usw.)[retikulär = netzartig" oder ,,netzförmig" ] besitzen. Zum Beispiel sollte bei einer Präparation einer Maus die Milz als erstes entnommen werden. Fazit hier: Solltest Du dich für die zoologische Histologie entscheiden, wirst Du an Formalin nicht vorbei kommen.

Leica hat das Rezept mit Buffer und auch eines ohne mit NaCl
https://www.leicabiosystems.com/de-de/knowledge-pathway/fixation-and-fixatives-4-popular-fixative-solutions/
1. Phosphatgepuffertes Formalin
Formulierung
100 ml Formaldehyd 40 %
900 ml destilliertes Wasser
4 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat
6,5 g wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat
Die Lösung sollte einen pH-Wert von 6,8 haben.
Fixierungszeit: 12-24 Stunden
Scheinbar wird ohne Puffer das Formalin zu Ameisensäure abgebaut.
Habe das noch nicht getestet.

Die Größe scheint auch eine Rolle zu spielen. Größer als 5mm soll es nicht sein, eher kleiner.
Die Fixierzeiten verlängern sich dann, wenn zu groß.

Wie immer Sicherheitsmaßnahmen beachten. Safty first.
Schutzbrille, Handschuhe, Gläser vor umkippen sichern.
Tropfmengen aufnehmen.
Augenwaschflüssigkeit oder Wasserhahn in der Nähe.

Ich erzähle das, weil wir als Kinder am Meer Seesterne gesammelt haben.
Einer wollte den Seestern mit Formalin für zu Hause haltbar machen(Geruch). Beim Einspritzen mit der Nadel ging ein Teil ins Auge. Ich bin mit ihm dann zum Waschhaus gelaufen und wir haben das Auge ausgespült. Es ging gut aus.

Liebe Grüße
Rudolf


Das Bild ist eine Hundepfote?? stand auf jeden Fall auf dem Block
und hat nichts mit dem Thema davor zu tun. Nur zum Zeigen. Stiched mit 20x Apo aus 20 Bildern.
Gefühlt hat hier das Eosin nicht richtig gefärbt. Vielleicht kann man es leicht mit Essigessenz ansäuern, damit die Färbung verstärkt wird. Das wäre dann 1ml Essigessenz 20% auf 10ml Eosin - mal sehen.

[K. B.]

Hallo Rudolf,

die gepufferte Formalin-Lösung ist in etwa der Standard wenn es um Fixierung geht und wenn man an die Inhaltsstoffe kommt auch gut anzuwenden.
Die Probengröße hat immer Einfluss darauf wie schnell das Fixans bis in die Mitte vorgedrungen ist, deshalb ist vorallem bei sehr enzymreichen Geweben wichtig, das die Proben klein genug sind oder z.B. über die Blutgefäße vorfixiert werden, so dass autolytische Prozesse weitestgehend verhindert werden.

Ich nutze auch gerne Glyoxal für die Fixierung, das dringt schneller in die Gewebe ein und ist auch für Privatpersonen erhältlich.
Auserdem ist es etwas weniger ungesund im Vergleich zu Formalin und gast weniger aus.

Man muss aber beachten, das vor allem bei Trichrom und anderen Spezialfärbungen Abweichungen oder Probleme auftreten können und weniger Informationen zu morphologischen Veränderungen bei unterschiedlichen Geweben vorhanden sind.

Viele Grüße
Kay

[rlu]

Hallo Kay,

ich habe das gefunden zu Glyoxal:
https://www.laborjournal.de/rubric/tricks/tricks/trick208.php
"Für eine Gruppe um Silvio Rizzoli von der Universität Göttingen war deshalb klar, dass endlich eine moderne Fixiersubstanz her musste, die weder die Gesundheit der Wissenschaftler noch ihre Experimente negativ beeinflusst"

"Nach den Angaben der Gruppe war dies bei pH-Werten zwischen 4 und 5 der Fall. Zudem waren 10 bis 20 Prozent Ethanol in der Lösung nötig, um die Morphologie der fixierten Zellen zu erhalten. Fehlte der Alkohol oder war der pH-Wert zu hoch, änderte sich die Zellstruktur durch die Fixierung."

Es gibt also endlich eine echte Alternative zur Formaldehyd-Fixierung, die deutlich weniger gesundheitsschädlich ist und darüber hinaus zu besseren Färbe-Ergebnissen führt.

Es scheint auch  leicht biologisch abbaubar zu sein. Und Glyoxal-Dämpfe sind weniger flüchtig und gelten als gesundheitlich weniger bedenklich.

Gibt es dafür eine genaue Anleitung?
Wird das jetzt standardmäßig verwendet?

Andere Frage: man wäscht doch nach der Fixierung das Fixiermittel aus der Probe mit Wasser aus. Erst dann wird entwässert mit Alkoholstufen, dann Paraffineinbettung über vorhergehendes Zwischenmedium(Iso, Xylol oder Butanol)
D.h. es sollte kein Fixiermittel mehr im Paraffin-Block vorhanden sein, wenn man es richtig macht?
Damit auch keine Umweltbelastung beim Schneiden.


Liebe Grüße
Rudolf

1. Formaldehyd (CH₂O)
Definition: Dies ist die reine chemische Substanz. Bei Raumtemperatur ist es ein stechend riechendes, farbloses Gas.

Relevanz für die Fixierung: Da es als Gas nicht praktikabel ist, wird es nie in dieser reinen Form für Gewebeproben verwendet. Es ist der aktive Wirkstoff, der die Fixierung durch Quervernetzung von Proteinen bewirkt.

2. Formalin
Definition: Dies ist die handelsübliche, wässrige Lösung von Formaldehydgas.

Standardkonzentration: In der Regel enthält Formalin 37–40 % Formaldehyd (Gas), gelöst in Wasser, meist mit geringen Mengen Methanol (10–15 %) als Stabilisator, um eine Polymerisation (Trübung) zu verhindern.

Verwechslungsgefahr: Wenn im Laborjargon von "100 % Formalin" gesprochen wird, ist meist diese konzentrierte Stammlösung (also 37–40 % Formaldehyd) gemeint, nicht reiner Formaldehyd.

3. Formol
Definition: Dies ist die gebrauchsfertige Fixierlösung.

Konzentration: Formol ist eine verdünnte Lösung. Standard ist 4 % gepuffertes Formaldehyd (auch als "4 % PFA" oder "10 % gepuffertes Formalin" bezeichnet).

Wichtig: Da die Stammlösung (Formalin) 37–40 % enthält, wird sie 1:9 verdünnt, um Formol herzustellen. Daher entspricht 10 % Formalin (Formol) ≈ 4 % Formaldehyd. 1/(9+1) = 1/10
siehe Rezept zuvor.

[K. B.]

Hallo Rudolf,

bei der Glyoxal Fixierung nutze ich auch eine leicht Sauer gepufferte Lösung mit etwas Ethanol, bei Glyoxal muss man aufpassen nicht ins basische zu kommen, da es dann Salze bildet.
Zu dem Thema findet man einige Paper die gute Ergebnisse zeigen.
Auswaschen ist immer sinnvoll wenn ein Puffer oder reaktive Substanzen in der Fixierung verwendet wurden, da diese nachfolgende Färbungen beeinträchtigen können.
In den standardmäßigen Gebrauch in z.B. Kliniken hat es diese Fixierung soweit ich weiß aber noch nicht geschafft, da dann einige Prozesse umgestellt werden müssten und man sich dort häufig an Richtlinien oder Vorschriften zur Fixierung halten muss wobei die Datenlage zu Glyoxalfixierung aber noch zu dünn ist als das man sie einfach so freigibt.

Viele Grüße
Kay

[rlu]

Hallo,

verändere meine Parameter beim Färben. Das dauert. Aber die Strukturen sind schon eine Pracht.
Pfote-Hund.



3D


3D Cyan, leider nicht so brilliant wie in der Kreuzansicht

[rlu]

Hallo,

und noch was interessantes
Was ist das für ein rotes Gebilde? Zellstruktur, große Poren?
Drüse?
Warze?


3D


3D Cyan


Stack


Liebe Grüße
Rudolf

[Alfons Renz]

Lieber Rudolf,

Die von Haidenheim in Tübingen entwickelte AZAN-Färbung überwältigt wirklich mit ihren Farben - aber um Strukturen richtig interpretieren zu können, reicht kein Kreuzblick oder Stacking: Man braucht eine Schnittserie, um der Verlauf der Strukturen zu verstehen.

Vermutlich handelt es sich bei Deinen braun-gelben 'Inseln' im blau gefärbten Bindegewebe um die Wurzeln der Behaarung (Haarfollikel; => Keratin gelb). Oder um Drüsen (Schweiss- oder Talkdrüsen). Oder die Basis der Krallen: Ein paar Schnitte tiefer, und Du weisst es.

Viel Erfolg!

Alfons