Auswaschen und Lagern von fixierten Proben

[rlu]

Hallo,

was meint die KI zum Auswaschen und Lagern in 70% Alkohol.
Das Thema Auswachen und Lagern von fixierten Proben wird meistens übersehen oder es kommt zu kurz.
Wäre interessant was andere drüber denken.


Wie und wie lange muss man fixiertes Material auswaschen?
Ziel: Das Auswaschen dient dazu, das Fixativ (meist Formaldehyd/Formalin) aus dem Gewebe zu entfernen. Fixativreste können spätere Färbungen stören, die Antigenität für Immunfärbungen beeinträchtigen oder im Laufe der Zeit das Gewebe weiter schädigen.

Wie:
Spülmedium: Verwenden Sie in der Regel Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) oder 0,9 %ige Kochsalzlösung (NaCl) . Bei reiner Routine-Histologie (nur H&E) ist oft auch fließendes Leitungswasser üblich, für empfindliche Nachweise (IHC, PCR, Elektronenmikroskopie) sollte jedoch gepufferte Lösung verwendet werden.

Methode: Das Gewebe sollte in einem ausreichend großen Volumen der Spülflüssigkeit liegen. Es ist wichtig, die Flüssigkeit regelmäßig zu wechseln (z. B. 3- bis 5-mal über den Waschzeitraum verteilt), um den Konzentrationsgradienten des Fixativs effektiv abzutransportieren. Bei Verwendung von PBS empfiehlt sich sanftes Schütteln (z. B. auf einem Schüttler).

Wie lange:
Die Dauer hängt von der Größe des Gewebes und der Fixierungsdauer ab. Als Faustregel gilt:

Kleine Biopsien (< 5 mm): 2–4 Stunden bei mehrfachem Wechsel des Waschpuffers.

Größeres Gewebe: 6–12 Stunden (über Nacht) bei kontinuierlichem Wechsel oder fließendem Wasser (falls Wasser verträglich).

Wichtig: Bei sehr langer Fixierung (z. B. über Wochen) muss entsprechend länger gewaschen werden. Wenn Sie das Gewebe nach dem Waschen in 70 % Ethanol überführen möchten (siehe Lagerung), reicht oft ein kurzes Waschen (30–60 min in PBS), da das Ethanol später das Fixativ ebenfalls auszieht.


Überfixierung
Unter Überfixierung versteht man, dass das Gewebe länger im Fixativ (meist Formalin) bleibt, als für die vollständige Durchfixierung nötig wäre (z. B. Tage oder Wochen statt Stunden).
A) Übermäßige Vernetzung (Crosslinking)
B) Erhöhte Brüchigkeit und Härte
C) Nukleinsäure-Degradation
D) Basophile Verfärbung

Zusammenfassende Empfehlung
Fixierung: Nicht länger als 24–48 Stunden (je nach Größe) in Formalin belassen.
Waschen: Nach Fixierung 2–4 Stunden in PBS (mehrfach wechseln) oder 30–60 Minuten unter fließendem Wasser.
Lagerung: Zur kurzfristigen Aufbewahrung (Tage/Wochen) in 70 % Ethanol oder in PBS mit Natriumazid bei 4 °C.
Langzeitlagerung: Am besten direkt nach der Fixierung in Paraffin einbetten oder als Gefrierschnitt (in OCT) bei -80 °C lagern.

PBS (Phosphatpuffer-Salzlösung) – ein pH-stabiler, isotoner Puffer, der das Gewebe in einem naturnahen Milieu hält.


Härtet 70 % Ethanol die Probe und verschlechtert die Schneidbarkeit?
Ja, das ist korrekt – aber mit Einschränkungen.

Mechanismus: Ethanol entzieht dem Gewebe Wasser und denaturiert Proteine teilweise. Dadurch wird das Gewebe fester, manchmal spröde.

Auswirkung auf die spätere Schneidbarkeit:

Bei kurzer Lagerung (Wochen bis wenige Monate) ist der Effekt in der Regel reversibel. Während der anschließenden Einbettung wird das Gewebe durch die steigenden Alkohol-Konzentrationen (bis 100 %) und Xylol/Intermedium weiter entwässert und schließlich mit Paraffin infiltriert. Ein gut eingebettetes, vorher in 70 % EtOH gelagertes Gewebe lässt sich meist einwandfrei schneiden.

Bei sehr langer Lagerung (Monate bis Jahre) in 70 % Ethanol kann das Gewebe übermäßig austrocknen und brüchig werden. Dies führt dann tatsächlich zu Rissen, Ausfransungen oder Vibrationen am Mikrotom.

Alternativ: Wenn Sie das Gewebe länger als 3–6 Monate lagern müssen, ohne es einzubetten, ist PBS + Natriumazid bei 4 °C die schonendere Methode, da es das Gewebe nicht weiter austrocknet oder härter macht. Allerdings müssen Sie hier strikt auf Keimfreiheit achten.

Fazit zur Härtung:
70 % Ethanol ist ein bewährter Kompromiss. Es verhindert Schimmelbildung (im Gegensatz zu reinem PBS) und bewahrt die Morphologie gut, macht das Gewebe aber fester. Für die allermeisten Routinezwecke (H&E, Immunhistochemie) ist das unproblematisch. Falls Sie später besonders empfindliche Antigene oder extrem dünne Schnitte (z. B. 1–2 µm) benötigen, ist die Lagerung in PBS + Azid (oder das sofortige Einbetten) vorzuziehen.


Liebe Grüße
Rudolf

[B.Neuhaus]

Lieber Rudolf,

es hängt immer davon ab, wie man die Proben weiter behandeln will. Sind Nachweisreaktionen geplant, darf die Fixierung nicht zu lange dauern (nur wenige Stunden bei Objekten um 1-2 mm), damit die Proteine nicht zu stark quervernetzt sind. Will man hingegen Proben für lange Zeit aufbewahren, muss die Probe mindestens 14 Tage in 4 % Formaldehyd (gerne gepuffert) verbleiben. Diesen Zusammenhang hat H. F. Steedman 1976 in seinem Buch "Zooplankton fixation and preservation" beschrieben (https://unesdoc.unesco.org/ark:/48223/pf0000018592). Außerdem empfehlenswert: J.A. Kiernan (2015) "Histological and histochemical methods", 5. Auflage (https://dokumen.pub/histological-and-histochemical-methods-theory-and-practice-5th-edition-9781907904776-1907904778.html). Beide Bücher enthalten Rezepte und erläutern die chemischen Mechanismen.

Nach der Fixierung in Formaldehyd werden Museumsproben (!) gewässert (Objekte 1-2 mm je 10 min, größere 30-60 min, evtl. mehrfacher Wechsel des Mediums einer Stufe) und in einer aufsteigenden Ethanolreihe entwässert (40 %, 60 %, 70 % 75 %). Zu hohe Alkoholkonzentrationen härten das Gewebe zu stark. Man kann biologisches Material auch Jahrzehnte lang in 4 % Formaldehyd lagern.

Die Aufbewahrung in Alkohol ist weniger gesundheitsschädlich als die in Formaldehyd, und der Schnaps greift die Deckel von Twist-Off-Gläsern auch weniger schnell und weniger stark an. Hier kommt also noch eine weitere Komponente hinzu, nämlich das Aufbewahrungsgefäß. Glasgefäße leiden nämlich stark unter Glaskorrosion durch Wassereinwirkung über Jahrzehnte. Das sieht man erst, wenn man die Gläser trocket. Dann erscheinen die Gläser stumpf, milchig-opak oder regenbogenfarben, vergleichbar wie zu häufiges Waschen von Trinkgläsern in der Spülmaschine. Die korrodierte Glasoberfläche ist stark reaktiv und kann empfindliche Proben bei direktem Kontakt schädigen.

Die von Deiner KI angegebenen Empfehlungen beziehen sich mehr auf Gewebe für Nachweisreaktionen. Dazu gibt es gerade in der Medizin sehr viel Literatur, und das spiegelt meines Erachtens auch der von Dir präsentierte Text wieder. Ich würde mich nie auf KI-generierte Inhalte verlassen, da man keine Literaturquellen hat und nicht erkennen kann, worauf genau sich der generierte Text bezieht; zumindest hast Du keine Literaturquellen angegeben. Ich würde mir immer den Einzelfall genau anschauen und die spezifischen Anforderungen, erst dann kann man sinnvoll die passende Literatur suchen und entscheiden, wie man Material fixiert und lagert. Meine Angaben basieren auf 30 Jahren Arbeit in einem naturkundlichen Museum, da sind die Anforderungen sicherlich anders als bei Nachweisreaktionen.

Die Literatur zu diesem Thema ist umfangreich, da kann man viel lesen, wenn man möchte  .

Viel Erfolg und beste Grüße
Birger