Ersuchen um konkrete Vor-Ort-Hilfe Mikrophotographie südl. von München

[xammax]

Hallo,

ich habe jetzt erste kleine Fortschritte gemacht. Ich baue gerade das ganze System neu auf, habe das Labor umgestellt, das Mikroskop steht auf einem weitgehend wackelfreien Tisch, habe die Lichtquelle noch etwas verbessert, alles geputzt, das Leitz Fluotar Objektiv als Hauptobjektiv eingebaut, den anderen Trinokoluartubus installiert, damit eine viel einfachere Adaptation erreicht und habe begonnen vom 10er Objektiv aufwärts im Hell- und Dunkelfeld Aufnahmen mit der Mikrometerskala zu machen, um hier möglichst scharfe Aufnahmen hinzukriegen. Ich werde hieran jetzt erstmal weiterarbeiten. Ich denke auch, daß der allererste Schritt eine möglichst perfekte Kameraadaptation sein muß. Hierzu werden sich sicherlich in den nächsten Tagen Fragen ergeben.

Um Ihnen einen Eindruck von der erwähnten Bild-Dynamik zu vermitteln habe ich drei Bilderserien hochgeladen:
http://www.mjkraus.de/download/mikrobilder/!Slideshows/030_5_bilder.exe 1,3 MB, ca. 1/2 Stunde Beobachtungszeit
http://www.mjkraus.de/download/mikrobilder/030_Anfang.exe 7,3 MB, ca. 2 Stunden Beobachtungszeit
http://www.mjkraus.de/download/mikrobilder/030_kurz.exe 35,5 MB, ca. 12 Stunden Beobachtungszeit
(die Exe-Dateien sind bei mir geprüft und Virus-frei)

Die gesamte Sequenz hat über 800 Bilder und eine Beobachtungszeit von 5 Tagen, insgesamt 190 MB. Falls Interesse besteht, kann ich diese natürlich auch gerne hochladen, das dauert aber ein paar Stunden. Aufgenommen ist bei einer 63er Vergrößerung, angezeigt wird ein mittlerer Bildausschnitt. Nach ca 24 Stunden läßt die Bildaktivität merklich nach und nach und nach erstarrt das ganze Bild. Das Endstadium nach 5 Tagen, so wie ich es regelmäßig gesehen habe, sieht in etwas so aus:


Meines Erachtens nach handelt es sich um mehr, als reine Molekularbewegung und physikalische Effekte, abschließend beweisen kann ich das bislang nicht. Was meinen Sie dazu?

Viele Grüße
mjk

[Klaus Henkel]

Meines Erachtens nach handelt es sich um mehr, als reine Molekularbewegung und physikalische Effekte, abschließend beweisen kann ich das bislang nicht. Was meinen Sie dazu?

Ich habe mir nur den ersten "Film" intensiver angeschaut. Es ist immer dieselbe "Bewegung", die sich ständig wiederholt, kein einziges Bilddetail zeigt irgendeine Ortsbewegung. Das jeweils übernächste Bild wiederholt in allen Einzelheiten die Positionen. Es ist nicht die geringste Art von Bewegung zu erkennen. Die Strukturdetails bleiben über die gesamte Bildstrecke völlig unverändert

Haben Sie bei der Aufnahme irgendeinen Motor laufen gehabt? Die Aufnahme vermittelt mir den Eindruck als würde sich die gesamte Apparatur nach jedem Bild in der Höhe verstellen (Entfernung Objektiv:Präparat), aber alle zwei Bilder nacheinander wiederholen. Da scheint mir etwas mechanisch nicht in Ordnung zu sein.

Mich würde mal interessieren, wie "Blutplasma" unter dem Mikroskop studiert werden kann, ohne dass die Zellen zerstört werden. Da Plasma gerinnt,
müßte man gerinnungshemmende Substanzen beifügen, die dazu verwendeten Substanzen sind pH-aktiv, verändern also das Präparat wesentlich.

Entnommenes Blut, das man auf einen Objektträger aus Glas bringt: Wie lange lebt das denn? Ich denke, daß es binnen 28 bis 32 sec koaguliert. Danach rührt sich darin doch wohl nichts mehr. Wissen Sie näheres? (Ich bin weder Mediziner noch Biologe, noch war Blut eines meiner Mikro-Steckenpferde.) Doch ich möchte aufgrund der rhythmischen, nach jeweils zwei Aufnahmen ständig wiederholenden Aufnahmen bezweifeln, daß die Aufnahmen irgendeinen realen Sinn ergeben. Könnte es sein, daß die verwendete Software ständig die beiden ersten Aufnahmen wiederholt?


Der zweite Link, dessen Datei ich ebenfalls heruntergeladen habe, läuft bei mir bei jedem Versuch nur nur 4 sec. Das ist zu wenig zum Beobachten.

Beim dritten Link habe ich den Eindruck mehrerer, zum Teil recht unterschiedlicher Bewegungen. Doch will ich das nicht jetzt gewichten, sondern erst wenn die Merkwürdigkeiten des ersten aufgeklärt sind.

Bin skeptisch.

Schöne Freitagsabendgrüße!
KH

[reblaus]

Hallo -
erst eine IT-Frage: Kann man die Bildsequenzen als Einzelbilder hintereinander betrachten? Bei mir läuft das wie ein Film ab und ich kann das Programm danach nur per Dreifingergriff mit dem Task-Manager wieder vom Schirm bekommen.
Trotzdem - nach dem was ich gesehen habe, frage ich mich zunächst, ob sich da im Dunkelfeld überhaupt noch was an der Auflösung verbessern läßt.
Zur weiteren Diskussion wäre die Schichtdicke und etwas mehr über die "Untersuchungskammer" interessant und was außer den Thrombos noch im Serum enthalten ist (O₂, CO₂, ATP ....).
Ein schlichter Versuch wäre, die ganze Sache schnell und strukturschonend zu fixieren (z.B. Osmiumtetroxid). Die Protozoen-Strukturforscher machen das z.B. mit den Pseudopodien von Actinophryis und das sind sehr zarte Gebilde. Dann der Vergleich im Mikroskop: Wimmeln die Fixierten nun nicht mehr?
Ich glaube der Aufwand lohnt sich, weil es scheint, dass man auch aus den Artefakten noch Erkenntnisgewinn ziehen könnte.
Gruß
RB

[xammax]

Lieber Herr Henkel, lieber Herr Reblaus,

vielen Dank für Ihre kritischen Anmerkungen!

Zuerst zur Frage der Bildgewinnung und Software:
Ich habe die Bilder damals (oben rechts ist der November 2005 als Aufnahmedatum angezeigt) mittel eines undulierenden Z-Triebes aufgenommen, der in kleinsten Schritten sinusförmig um einen Mittelpunkt kreist. Ich habe dann automatisch alle 30 Sekunden ein Bild aufgenommen und das ganze einfach laufen lassen. Alle paar Stunden habe ich durchs Okular geschaut und nachgestellt, das erklärt die ruckhaften Veränderungen in der langen Sequenz.
Jetzt habe ich also 807 Einzelbilder als JPG vorliegen (ein ungünstiges Format, das habe ich zwischenzeitlich auf RAW geändert). Mit IrfanView kann man sog. Slideshows erstellen. Man lädt alle Bilder in einen Stack, gibt die Zeit für den Sprung zur nächsten Datei an (aktuell 0,01 s) und es wird einem eine exe-Datei, wie die bereitgestellten, erzeugt. Man erhält dann aus den Einzelbildern einen Zeitrafferfilm, den man nicht weiter bearbeiten kann.

Ich wollte gestern erst die ganze Sequenz hochladen, habe dann erst gesehen, uups 190 MB, da wird sich keiner freuen. Habe dann kürzere Sequenzen erstellt, die einzig wirklich zumutbare Dateigröße von 1,3 MB hat dann auch nur insgesamt 5 Bilder (wie der Dateinamen auch sagt). Ich habe hierzu aus der ersten halben Stunde jeweils ca jedes 10. Bild genommen und in den Stack eingefügt. Die Schleife ist auf loop gestellt, weil 5 Bilder ja sofort vorbei sind. Ich wollte hiermit eigentlich nur Ihr Interesse und die Neugier an dem Download einer größeren Datei wecken. Den Film beenden kann man jederzeit mit der Escape-Taste. Ich würde Ihnen und jedem anderen Interessierten gerne eine CD mit den Originalbildern und ggf. einer Slideshow brennen und zuschicken, damit Sie sich ein eigenes Bild machen können. Die 807 Einzelbilder von dieser Untersuchung haben einen Gesamtdateigröße von 529 MB.

Zur Präparation und Haltbarkeit von Blut nach der Abnahme:
Ich hatte weiter oben erwähnt, daß ich mit Natrium-Citrat versetztes Blut verwende. Natrium-Citrat bindet die Gerinnungsfaktoren und macht das Blut ungerinnbar. Es beeinflusst aber nicht die Thrombozytenfunktion. Blut kann nur durch ein Zusammenwirken von Gerinnungsfaktoren und Thrombozyten gerinnen. Störungen des einen wie des anderen System führen in vivo zu einer gesteigerten oder verminderten Gerinnungsfunktion (z.B. Faktor-V-Leiden, Hämophilie, Thrombozytopenien, Thrombozytopathien usw. stellen alle schwere Gerinnungsstörungen dar, die zu einer erhöhten Thromboseneigung auf der einen Seite oder einer erhöhten Blutungsneigung auf der anderen Seite führen).
Wir arbeiten mit sog. PRP, d.h. Platelet Rich Plasma (=Thrombozytenreiches Plasma). Da ich meinen ganzen finanziellen Wagemut zusammengenommen habe und auf dieses Verfahren erst kürzlich ein Patent angemeldet habe, dessen Anmeldung noch nicht vollständig abgeschlossen ist, möchte ich die einzelnen Präparationsschritte hier (im Internet) nicht schriftlich darlegen, ich werde Sie aber Ihnen und jedem anderen, der interessiert ist, gerne telefonisch erläutern. Und natürlich würde ich mich freuen, jedem Interessierten das ganze auch einmal Live zu demonstrieren. Auf meiner Webseite http://www.mjkraus.de finden Sie alle Kontaktdaten. Ich habe diese Woche Bereitschaftsdienst, Sie können mich jederzeit erreichen. Nur Schriftliches ist hier nicht so gut, da die Präparation einer der Kernpunkte der ganzen Geschichte ist.
Ich arbeite letztlich also mit einer Thrombozytenkultur, in der die Thrombozyten tatsächlich über einige Tage überleben.
PH und Ionenkonzentrationen spielen eine bedeutende Rolle. Das Citratblut ist deshalb auch gepuffert und hält den pH weitgehend konstant. Das ist übrigens nicht auf meinem Mist gewachsen sonder ein durchaus übliches Präparationsverfahren für Thrombozyten. Nur daß praktisch alle sonstigen Untersuchungsverfahren den Thrombozyten dann zu einem bestimmten Zeitpunkt fixieren und in dann meistens elektronenmikroskopisch darstellen.
Natürlich spielen auch die anderen Plasmabestandteile eine Rolle, ich habe eine ganze Weile lang eine komplette Serumuntersuchung mitlaufen lassen, da scheint vieles eine Rolle zu spielen: Zuckergehalt, Cholesterin, Natrium, Kalium, Calcium, auf jeden Fall ATP usw. Aber mir fehlt ja ein effizientes Quantifizierungssystem um diese ganzen Effekte nach und nach sinnvoll zu dokumentieren, deshalb bin ich ja letztlich hier.

Zur Bewegung
Mich interessiert primär die Beweglichkeit und das Wachstum der Thrombozytenfortsätze. Direkt nach Präparation kann man praktisch nur Thrombozyten in Scheibchenform, ohne Fortsätze sehen. Nach einer gewissen Lagerungszeit von z.B. 2 Stunden haben sich die meisten Thrombos abgesenkt und werden vermutlich durch die Aktivierung mit Glas (das legen zumindest die Untersuchen von Breddin et al. aus den 70er und 80er Jahren nahe) aktiviert. Der thrombozytäre Formwandel (sog. Shape-Change) ist ein ziemlich heiß diskutiertes Thema und bei weitem nicht abschließend geklärt. Es gibt aber auch in-vivo Untersuchungen, bzw. Untersuchungen an Gefäßmodellen in der Flow-Chamber, die ein entsprechendes Thrombozytenverhalten zeigen.

Zur Fixation
Können Sie mir hierzu näheres sagen, wie die Fixation z.B. mit Osmiumtetroxid funktioniert? Ich habe ja das Problem, daß die Effekte sich erst im Präparat/in der Kultur zu entwickeln scheinen. Ich hatte an so etwas wie ein Schockgefrieren oder ähnliches gedacht, bin hier aber noch nicht voran gekommen.

Viele Grüße
mjk