DIY Auflichtfluoreszenz, verschiedene Filter, LED's

[MS19]

Wie sieht es da in den Bereichen außerhalb des sichtbaren Spektrums aus? Zum einen im Bereich von 250-400nm und dann auch bei 950nm.

Unterhalb 350 nm gibt es nur noch Spezielobjektive, die dann noch eine gute Transmission zeigen. Fluare gehen typischerweise noch bis ca. 330 nm herunter, dann aber ist auch damit ein Ende. Im Infrarot-Bereich ist die Transmission meist nicht so abrupt endend, so dass hier einige Objektive noch gut weiterarbeiten, insbesondere dann, wenn sie auch für die 2-Photonen-Mikroskopie optimiert sind. Wer im UV-B oder gar im UV-C-Bereich anregen will, tut dies besser mit einer externen Lichtquelle, die nicht über das Objektiv eingekoppelt wird. Im Infrarot-Bereich kommt es auf einen Versuch an, was dort noch erreichbar sein mag. Oft sind die Objektive dabei weniger limitierend, als die digitalen Kameras, die ohne einen speziellen Umbau typischerweise mit einem Infrarot-Sperrfilter ausgestattet sind.

[Spectrum]

Ok, die Limitierung durch die Objektive im unteren UV-B und UV-C Bereich ist klar. Da braucht man dann spezielle Optiken z.b. aus Quarzglas. Ich glaube bei Zeiss gab es auch spezielle Ultrafluare für diesen Zweck.

Wer im UV-B oder gar im UV-C-Bereich anregen will, tut dies besser mit einer externen Lichtquelle, die nicht über das Objektiv eingekoppelt wird.

Wie sieht denn da die Umsetzung konkret aus? Durchlicht mit Quarzkondensoren, bzw. mit einem zweiten Spezialobjektiv als Kondensoroptik?

Aber zurück zu meiner eigentlichen Frage. Ganz konkret.
Wie verhält sich beispielsweise eine Nichia 3Watt LED im Vergleich zu einer klassischen Quecksilberdampflampe?
Ist eine LED selbst da noch überlegen?
Viele Filterwürfel und die darin befindlichen Filter sind ja häufig auch immer noch auf die typischen Linien der alten Beleuchtungen ausgerichtet (365nm, 386nm)
Grüße Holger

[Spectrum]

Was meine konkrete Fragestellung für den IR Bereich bei 950nm angeht, weiß ich, daß ich da um einen Kamera Umbau oder eine Industriekamera nicht herumkomme. Aber was ich nicht genau weiß, ist ob ich was die Beleuchtung angeht besser mit einer Halogenleuchte und passendem Filter bedient bin, oder ob sich die Adaption einer 3Watt IR LED (Oslon Black) lohnen würde. Laut Datenblatt hätte die eine "radient Intensity" von 1340mW unter Vollast , wobei der Strahlwinkel und die Emittergröße gut zu meiner Beleuchtungsoptik passen würden.
Aber da schweife ich jetzt auch schon vom ursprünglichen Thema dieses Fadens ab. Ich würde damit gerne den Chitinpanzer von Insekten durchleuchten. Wäre toll wenn da auch für Filmaufnahmen genug Leistung ankommt.
Aber das hat nichts mit Fluoreszenz zu tun.
LG Holger

[TStein]

Hallo in die Runde,

danke auch für die interessante Diskussion. Ich beschäftige mich nicht so wirklich mit biologischen Proben und Fluoreszenz, habe aber an meinen Hobby-Mikroskopen (Leica DMI6000, Leica DM6000) einige Filterwürfel und zwei Spezial-Lichtquellen. Eine Schott-HXP120 und eine Andor AMH-200-F0/6S, mit 200W Metal-Halide-Lampe. Die Andor-Quelle hat gleich 4 schnell schaltbare Filter eingebaut und auch einen Lumatec Flüssiglichtleiter. Die ist schon ziemlich hell und war ursprünglich bei einem Andor Revolution DSD2 Confocal-Modul dabei. Leider hat die DSD2 den Transport aus den USA nicht überlebt, die Spinning-Disk-Scheibe war leider zerbrochen. Die DSD2 hat die zur Andor-Quelle passenden 3 Fluoreszenzfilterwürfel eingebaut. Vielleicht hast du, Michael, diesbezüglich auch ein paar Tipps oder Erfahrungen.
Aber natürlich soll der Faden nicht gekapert werden.

Lg Tino     

[MS19]

Wie sieht denn da die Umsetzung konkret aus? Durchlicht mit Quarzkondensoren, bzw. mit einem zweiten Spezialobjektiv als Kondensoroptik?

Ja, so oder mit schräger Beleuchtung (zur Fluoreszenzanregung) würde ich es versuchen. Durchlicht im eigentlichen Sinn würde natürlich ein von Dir bereits erwähntes Ultrafluar erfordern. Bei Fluoreszenz hätte man ja die längerwellige Emission, die dann vielleicht auch mit normalen Objektiven eingefangen werden kann. Schräg, um dem Problem der Autofluoreszenz der Gläser aus dem Weg zu gehen.

Wie verhält sich beispielsweise eine Nichia 3Watt LED im Vergleich zu einer klassischen Quecksilberdampflampe?
Ist eine LED selbst da noch überlegen?
Viele Filterwürfel und die darin befindlichen Filter sind ja häufig auch immer noch auf die typischen Linien der alten Beleuchtungen ausgerichtet (365nm, 386nm)

Die Quecksilberdampflampen hatte ich aufgrund der geringen Standzeiten und der für die quantitative Spektroskpie teils ungünstig liegenden Bänder schon herausgeworfen, bevor ich ein ordentliches Powermeter hatte und kann daher keine konkreten Zahlen hierzu liefern. Mal sehen, ob ich einen Brenner samt Vorschaltgerät aus dem Keller hochangeln kann (und will). Irgendwo müsste auch noch eine ältere X-Cite herumstehen, die ich mal bei Ebay geangelt hatte und deren Lumatec-Lichtleiter wir weiterverwenden.

Bei aktuell üblichen 3W-LED liegen die Lichtleistungen in einem mit NA = 0,7 kollimierten Strahl je nach Wellenlänge um ca. 50-600 mW, das ist knapp die Hälfte der nominellen Gesamtleistung eines Lambert´schen emitters (also ohne Halbkugellinse). Nichia habe ich nicht, sondern nur Lumileds (Luxeon Z, Luxeon CZ), LedEngin (LZ4 3 Ampère/10 W high-current RGBW und LZ4 365nm), Osram Ostar Stage 3A RGBW und kürzlich auch Cree XE G (3A) sowie Luminus SST UV-LED.

Einzelbeispiele kollimierter Lichtleistungen mit Konstantstromangaben sind:
540 mW bei Luminus 367 nm (1A)
640 mW bei Luminus 407 nm (1A)
1300 mW bei LedEngin 447 nm (3A)
960 mW bei Cree 470 nm (Blue oder PC Blue; beide 3A)
440 mW bei Cree 495 nm (Cyan; 3A)
270 mW bei Ostar Stage oder LZ4 525 nm (3A)
90 mW bei Luxeon Z 590 nm (Amber; 1A)
ca. 600 mW bei Weiß in LedEngin oder Ostar Stage (3A)
ca. 430 mW im gelben Phosphor-Band einer "fully converted" (RGBY) Ostar Stage (3A)

Zum Vergleich:
- Ein TILL Photonics Poly V bringt am kollimierten Lichtleiter im Peak (470 nm) etwa 12 mW, bei 365 nm gerade mal ca. 3-4 mW.
- Die Light Engines von Lumencor bringen je nach Modell und Version am Lichtleiterausgang gemessene 460-800 mW bei jeder der 7 Wellenlängenbänder der Spectra III (mit Ausnahme der wesentlich schwächeren 348 nm in der "Fura-2-Spezialversion" mit nur ca. 45 mW) oder 650-800 mW bei der Laser-gestützten Celesta.

Wie viel braucht man aber überhaupt?

Wenn Du eine 1 x 1 mm² LED mit NA 0,7 kollimierst, kannst Du sie ca. 10-fach vergrößert in die BFP projezieren und behältst dann immer noch die Ausleuchtung des gesamten Sehfeldes bei. Das bedeutet, dass Du die komplette Lichtleistung in ein 10x/0.5 eingekoppelt bekommst. Bei angenommener 500 mW Lichtleistung und einem 20-mm-Sehfeld sind das in der Fokalebene dann 0,5 W / (Pi * 0,1 cm²) = 15,9 W/cm². Selbst mit einem 20x/0.8 oder einem 40x/1.3, die etwas kleinere BFP-Radien haben, kannst Du noch einen großen Teil der Lichtleistung ausschöpfen und erzielst damit in der Fokusebene entsprechend hohe Lichtleistungen von ca. 60 W/cm² beim 20er oder fast 200 W/cm² beim 40er. In der Lebendzell-Mikroskopie bleichen wir bei 100 W/cm² ein "enhanced green fluorescent protein" innerhalb weniger Sekunden um mehr als 50% weg. Fixierte, mit stabilen Fluorochromen gefärbte und mit Antifade eingedeckelte Proben werden zwar deutlich stabiler sein, aber davon wollen wir a) keine Videos machen und könnten b) für ein Einzelbild auch länger belichten, so dass man die hohen Leistungsdichten ebenfalls nicht benötigt.

Fazit: sauber eingekoppelte LED bringen genug oder mehr als genug Licht für eine Lebendzell-Videomikroskopie in Epifluoreszenz.

[MS19]

Vielleicht hast du, Michael, diesbezüglich auch ein paar Tipps oder Erfahrungen.

Leider nein; ein spinning disc confocal hatte ich mir immer gewünscht, ist aber nie wahr geworden. Willst Du das Gerät reparieren? Falls nein: die Lichtquelle sollte aber auch für normale Epifluoreszenz sehr gut geeignet sein!? Ob man hierfür die Filter aus dem Konfokalmodul herausoperieren und weiterverwenden kann, weiß ich leider auch nicht.

Die Andor-Kamera ist ja in jedem Fall sehr gut und könnte direkt ans Mikroskop angesetzt entweder mit Andor Solis oder MicroManager angesteuert werden.

[Spectrum]

Hallo Michael,

Wie viel braucht man aber überhaupt?

Das ist wohl die eigentliche Kernfrage bei der ganzen Diskussion.


Meine bisherige Erfahrung hat gezeigt das die Leistung meines eigenwilligen Selbstbaus bis jetzt zumindest ausreichend war.
Was meine Videoaufnahmen lebender Einzeller angeht, hat man es, zumindest bei UV und Blauanregung, sowieso sehr schnell mit der Phototoxizität zu tun.
Das ist in der Regel das größte Problem!
Meist schon lange bevor sich Photobleaching bemerkbar macht. Das führt dann dazu das sich die beobachteten Organismen innerhalb kurzer Zeit (wenige Sekunden) unter der Lichteinwirkung regelrecht auflösen. Wie schnell genau hängt dabei offensichtlich von vielen Faktoren ab:

1. Art und Dosierung der Färbung:
Unterschiedliche Fluorophore wirken sich unterschiedlich auf die Lichtempfindlichkeit der gefärbten Einzeller aus. Ich hab da bisher noch nicht allzuviele Vergleichsmöglichkeiten konnte aber soweit schonmal feststellen, daß Acridinorange schneller zu Problemen führt als beispielsweise Rhodamin 6G. Die Dosisierung spielt auch eine große Rolle.
Auch habe ich bei Thilo Bauer gelesen, das es von Vorteil sein soll die Färbung (im konkreten Beispiel ging es auch um Acridinorange) erstenmal über einen längeren Zeitraum einwirken zu lassen. Thilo Bauer beschäftigt sich schon eine ganze Weile mit dieser Art der Lebendfärbung und weiß sicher wovon er da spricht. Dazu habe ich selbst aber noch nicht genug Erfahrungswerte.

2.Die individuelle Fitness:
Ja ganz recht, es ist tatsächlich eindeutig zu beobachten daß Individuen von Paramecium bursaria, die wohlgenährt und agil aus einer gut laufenden Kultur stammen, *deutlich* wiederstandsfähiger sind als Exemplare die schon eine Weile ohne Licht ausharren mussten). Ein fittes Exemplar verträgt z.b. die vollen 3Watt UV Licht über die Kondensorvariante mit Mattglaslinse über einen Zeitraum von 1/2-1min. So sind auch die Aufnahmen in meinem Beitrag entstanden. Dieselbe Kultur stand inklusive den Farbstoffen (Acridinorange+Hoechst33342) für weitere 3Tage im Kühlschrank. Dort haben sie sich sogar geteilt und waren augenscheinlich auch agil. Allerdings hatten sie bereits begonnen ihre endosymbiotischen Algen zu verdauen. Diese Exemplare hielten exakt die gleiche Lichtmenge keine 2Sekunden durch.

3. Die jeweilige Art des Einzellers/Mikroorganismus:
Verschiedene Arten sind sehr unterschiedlich robust, was UV und Blaulicht angeht. Amöben lösen sich schon bei 250-500mA (Stromstärke des Steuergeräts nicht Leistung der kollimierten Lichts!!! Zweiteres kann ich leider nicht messen) nach allerkürzester Zeit auf. "Fitte" Paramecien deutlich länger,  und Stentor coeruleus nach meiner Erfahrung noch länge, Bärtierchen ewig, da wäre noch mehr Lichtleistung schon ganz nett, zumindest während der Zeit der der Filmaufnahme.
Damit könnte ich die hohen Isowerte die ich mit meiner Sony benötige etwas reduzieren.
Entsprechende Aufnahmen dazu habe ich übrigens hier auch schon gezeigt:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=49992.msg365587#msg365587
Zu meinen Volvox Kolonien kann ich noch nichts verbindliches sagen da muss ich einmal schauen wie lange die pulsierenden Vakuolen und Flagellen unter Lichtbelastung noch funktionieren. Die Einzellzellen desintegrieren auch nach minutenlanger Bestrahlung nicht. Allerdings leidet dann die Autofluoreszenz sichtlich.

Grundsätzlich bin ich aber mit meiner Lösung bisher schon ganz gut aufgestellt, in manchen Situationen stoße ich aber dann doch an Grenzen. Von anderen eventuell noch lichtschwächeren Farbstoffen ganz zu schweigen. Deshalb wäre es von Vorteil in bestimmten Situationen die Lichtleistung für den Zeitraum der Aufnahme noch etwas höher schrauben zu können. Von dem getrennten Anregen über verschiedene Wellenlängen verspreche ich mir *sowohl* hellere Emissionen als auch gleichzeitig *weniger* Lichtbelastung.

Ausserdem werde ich mich in nächster Zeit auch eingehender mit der köhlerbaren Version des Kondensors beschäftigen, da dürfte einiges mehr möglich sein....
Sofern die Phototoxizität mir nicht schon früher einen Strich durch die Rechnung macht.

Danke auch für die konkreten Angaben der gemessenen Lichleistung der kollimierten Lichtquellen Michael, sowas ist besonders aufschlussreich.
Grüße Holger

[TStein]

Hallo Michael,

ich versuche derzeit die Andor-DSD2 zu reparieren. Ist im Grunde keine klassische Confocal Spinning-Disk, mit Nipkow-Scheibe, sondern eher eine etwas komplexere strukturierte Beleuchtung, wie das Zeiss Apotome. Nur dass hier die Strahlengänge aufgeteilt werden, daher sind auch die Fluoreszenzfilterblocks eher speziell. Ein Strahlengang schaut durch die rotierende mit einem groben metallischen Gitter strukturierte Scheibe in Transmission. Der andere Strahlengang tastet die Scheibe in Reflexion ab und beide Strahlengänge werden nebeneinander auf den Kameraport abgebildet. Mit einem bisschen Bildmathematik der beiden Bildhälften, bekommt man dann ein konfokalähnliches Bild. Die Scheibe hat es aber leider beim Transport zerlegt. Ich schaue aber, ob ich eine auf Arbeit herstellen kann. Wohl dem, der in einer Mikrostrukturierungsabteilung arbeitet.

Lg Tino