Berechnung der Schärfentiefe von Mikroskopobjektiven

[Jürgen Boschert]

Hallo Jürgen,

danke für die Aufstellung, das hilft.

Mir ist jetzt erst aufgefallen: In der Tabelle finden sich ja zwei Objektive mit gleicher Vergrößerung, aber unterschiedlicher Apertur das Apo !0x/0,4 und das Fluotar 10x/0,3. Den Unterschied in der Schärfentiefe bei nur 0,1 Unterschied in der NA finde ich schon beeindruckend.

[Lupus]

Hallo,

...dass bei gleicher NA eine größere Schärfentiefe erreicht wird, wenn eine kleinere Vergrößerung gewählt wird.

Hallo Frank,
das ist so. Hier ist eine kleine Tabelle, aus der das ersichtlich wird.

Die Tabelle zeigt aber nicht gleiche NA mit unterschiedlicher Vergrößerung, insofern ist es nicht allgemeingültig sondern nur im Einzelfall so. D.h. die erreichte Abbildungstiefe ist auch von der Pixeldichte der Kamera - bezogen auf den Durchmesser des Beugungsscheibchens - abhängig. Und die angenommene hohe Pixeldichte ist bei extremen Objektiven (sehr geringe Vergrößerung mit hoher NA) nicht automatisch gewährleistet.

Die Digitalkamera kann bei ausreichender Pixelauflösung Informationen aufnehmen, die das menschliche Auge nicht mehr schafft.

Das gilt auch umgekehrt, wenn die Mikroskopvergrößerung an die NA des Objektiv angepasst ist, erreicht das Auge die maximal mögliche Auflösung. Jeder kennt sicher die dazu gehörige Faustformel für die förderliche Vergrößerung 500*NA...1000*NA. Letzteres geht Richtung leere Vergrößerung, d.h. mehr kann auch mit hoher Pixelauflösung der Kamera nicht aus dem Bild heraus geholt werden. Der geometrische Anteil für die Abbildungstiefe gilt auch für Kameras insofern ist die Formel von Wartmann etwas vereinfacht, allerdings kann bei hoher Vergrößerung/hoher Kamerapixeldichte dieser Anteil im Vergleich zum beugungsedingten Anteil zunehmend vernachlässigt werden.

Hubert

[Nochnmikroskop]

Hallo zusammen!

Lieber Hubert,
deine Frage beantworte ich mal mit dem
Duden 2.a) einem Grundsatz (a) folgend, entsprechend; aus Prinzip, ohne Ausnahme

Hallo Jürgen (jcs),

danke für die Tabellen. Schön wäre, wenn noch die Werte der Schärfentiefe bei gleicher NA 0,5 bei 5x und 50x, und/oder auch 20x angegeben würden. Ich bin da sowohl mathematisch, als auch Excel technisch raus. Oder Du stellst die Tabelle (Endung in PDF ändern sollte klappen) zur Verfügung??

Die Abhängigkeiten vom Sensor sind sicher nicht trivial, aber die grundsätzliche Abhängigkeit von der Vergrößerung ist doch das entscheidende, oder?
Wenn ich grundsätzlich, ohne Ausnahme, immer   weniger Stackschritte benötige wenn ich geringere Vergrößerungen bei gleicher NA verwende, wäre dass doch das Ziel, zumindest für mich. Dann braucht man weniger oft stitchen und hat mehr Bildinhalt gleichzeitig verarbeitet.

Ins Grübeln komme ich allerdings bei den vielen höchst aufgelösten Bildern hier im Forum bei den Diatomeen. Warum wird nicht lieber mit einer geringeren Vergrößerung (z.B. 40x) und NA1,4 aufgenommen, statt mit 100x. Ist nicht auch dort (beim 40x) grundsätzlich der Bereich in Bildmitte etwas besser, als in den Außenbereichen?
Sind die z.B. 40x Objektive grundsätzlich, immer, ohne Ausnahme    schlechter, als 100x gleicher NA? Ist vielleicht sogar die geringere Schärfentiefe hier besser geeignet beim Stacken? Wenn dem so ist – wie wird das gemessen?

Eine Anmerkung noch zu den verwendeten Sensoren, es gibt ja noch Pixelshift.

Fragende Grüße vom Frank

[purkinje]

Hallo Frank,

Warum wird nicht lieber mit einer geringeren Vergrößerung (z.B. 40x) und NA1,4 aufgenommen, statt mit 100x.

Das könnte an der Seltenheit dieser Objektive und auch an ihrem Preis liegen. Ich habe jahrelang gesucht um ein bezahlbares und intaktes Leitz PlApo 40 Oel /1,0 zu finden und auch Pl Apos 63/1,4 fallen nicht gerade vom Himmel. Am idealsten wären Objektive wie das Zeiss PlApo 40/1,0 mit Irisblende, leider sind diese aus der Endlichzeit mittlerweile fast alle delaminiert.
Beste Grüße Stefan

[Lupus]

Hallo Frank,

meine Frage nach dem Begriff "grundsätzlich" war schon ernst gemeint. Jedenfalls ist es nicht "ohne Ausnahme" so dass bei gleicher NA eine größere Schärfentiefe erreicht wird, wenn eine kleinere Vergrößerung gewählt wird. Die Formel von Wartmann 1.228*n*λ/NA², nach der die Tabelle von Jürgen errechnet wurde, enthält ja gerade nicht die Vergrößerung. Nach der Formel kannst Du mit einem Taschenrechner leicht selbst jede Objektivkombination berechnen, bei der Wellenlänge wird meist Grün bei 0.55 µm angenommen. n der Brechungsindex des eventuellen Immersionsmediums.

Der Hintergrund dieser verkürzten Formel ist, dass durch die Lichtbeugung nicht nur ein zweidimensionales Beugungsscheibchen entsteht, sondern ein dreidimensionales Beugungsbild auch in z-Richtung. Diese Tiefe des räumlichen Beugungsbildes ist unabhängig von der Vergrößerung, wie ja auch das Beugungsscheibchen unabhängig davon ist, und nur von der NA abhängt. Diese Tiefenausdehnung bewirkt die Vergrößerung der Schärfentiefe.

Nur der z.B. in der ursprünglichen Formel von Berek enthaltene zusätzliche rein geometrische Anteil 350/(NA*V_ges) für visuelle Beobachtung erzeugt die Abhängigkeit von der Gesamtvergrößerung des Mikroskops. Die Idee hier ist dass der rein geometrische Strahlenkegel, mit dem das Objektiv das Licht vom Objekt sammelt, ein Unschärfescheibchen für den Objektpunkt außerhalb des Fokus in der Bildebene erzeugt. Und wenn man dieses Scheibchen mit der Mikroskopvergrößerung beobachtet, reicht die Tiefenschärfe bis zu dem Abstand von der Fokusebene, bei dem das immer größer werdende Scheibchen vom Auge gerade noch nicht auflösbar ist. Das gilt im Prinzip aber auch für den Kamerasensor. Da in der Praxis meist mehr Kamerapixel für die gleiche Bildgröße zur Verfügung stehen als beim Auge Zapfen und dadurch in der Praxis ein nur sehr geringer geometrischer Anteil zur Schärfentiefe beiträgt (denn der ist dann sehr klein), wird dieser vergrößerungsabhängige Formelteil meist vernachlässigt.

Hubert

[Stuessi]

Hallo,

mit einem Zeiss Discovery V.12 und Planapo 1,5x habe ich bei höchster Vergrößerung (150x mit 10x Okular) ein unter 45° geneigtes Objektmikrometer mit einer NEX-5N fotografiert.
Auf dem Foto abgelesene 10µm entsprechen dann 7µm Höhendifferenz.
Angezeigt auf dem ZEISS Human Interface Panel HIP wird für diese Einstellung eine Schärfetiefe von 11 µm und eine Auflösung von 0,8 µm (625 Lp/mm).

.

11µ Höhenunterschied entsprechen 16µm (anderthalb Skalenteile) auf der fotografierten Skale. Die Angabe von Zeiss ist also ziemlich realistisch.

Blende ich ab, so nimmt die Schärfentiefe zu und die Auflösung nimmt ab.







Zum Stacken reichen ca. 10 µm Höhenunterschied zwischen den einzelnen Aufnahmen:



Besser wird es mit 14 Bilder mit 5µm Höhenunterschied:




Viele Grüße,
Rolf




 

[Nochnmikroskop]

Nur der z.B. in der ursprünglichen Formel von Berek enthaltene zusätzliche rein geometrische Anteil 350/(NA*V_ges) für visuelle Beobachtung erzeugt die Abhängigkeit von der Gesamtvergrößerung des Mikroskops.  
Hubert

Hallo Hubert,
danke für die Klarstellung.

LG Frank