Hallo liebe Forumsmitglieder,ich möchte heute mal etwas kleines zeigen was ich in letzter Zeit versucht habe.
Und zwar habe ich mich genauer mit der PAS-Reaktion beschäftigt.
Die PAS-Reaktion (Perjodacid-Schiff-Reaction) ist eine histochemische Färbung, bei der insbesondere kohlenhydrathaltige Komponenten zum Beispiel Glykoproteine, neutrale Mukopolysaccharide, Glykogen und vieles mehr mit Hilfe von Perjodsäure und Schiff-Reagens nachgewiesen werden können.
Prinzip:Durch die Periodsäure, einem starken Oxidationsmittel, werden unsubstituierte Glycolgruppen zu zwei benachbarten Aldehydgruppen oxidiert.
Das Schiffsche Reagenz enthält fuchsinschwefelige Säure (farblose Leukobase des Fuchsins/Parrosanilins).
Durch Bindung an die Aldehydgruppen kommt es zu einem molekularen Umbau und ein magenta bis roter Farbkomplex entsteht.
Ansätze:Perjodsäure:
1g Orthoperjodsäure in 99ml aqua Dest lösen
Schiffs-Reagenz:
5g Parrosanilin in 150ml 1n HCl unter schütteln lösen (es entsteht eine Olivgrüne Lösung)
5g Kaliumdisulfit in 850ml aqua Dest. lösen
Beide Lösungen mischen und 24 Stunden dunkel und Kühl stehen lassen (hin und wieder umschwenken)
Nach 24 Stunden ist die Lösung Strohgelb
3g Aktivkohle-Pulver zugeben und 2-3 Minuten kräftig schütteln
2mal filtrieren
Die Lösung ist nun Farblos
Die Lösung ist gut verschlossen, dunkel und kühl gelagert mehrere Monate haltbar
Vor Gebrauch am besten auf Raumtemperatur erwärmen
Bei rot Verfärbung ist die Lösung unbrauchbar
Hämalaun nach Mayer:
1g Hämatoxylin in 1000ml aqua Dest. lösen
0.2g Natriumjodat und 50g Kalium-Aluminiumsulfat (Kalialaun) zufügen und kräftig schütteln (Lösung ist Blauviolett)
50g Chloralhydrat und 1g Zitronensäure zufügen und kräftig schütteln (Lösung ist nun rotbraun)
Vor Gebrauch filtrieren
Lösung ist sehr lange haltbar
Mein Färbeprotokoll:1. Schnitte entparaffinieren und in aqua Dest. bringen
2. Schnitte 5min. in 1% Perjodsäure-Lösung stellen
3. Schnitte spülen in aqua Dest.
4. Schnitte 10min. in Schiffs-Reagenz stellen
5. Schnitte 2mal spülen in aqua Dest.
6. Schnitte spülen in warmen Leitungswasser
7. Schnitte 5min. in Hämalaun nach Mayer stellen
8. Schnitte 2mal spülen in kaltem Leitungswasser
9. Schnitte 15 min. in warmen Leitungswasser bläuen
10. Schnitte entwässern über aufsteigender Alkoholreihe
11. Schnitte in Neo-Clear stellen und Eindecken in Neo-Mount oder Schnitte in Xylol stellen und Eindecken in Entellan
Färbeergebnis:Kerne - blau bis blauviolett
PAS-positives Material - magentarot
PAS-positiv ist vor allem:Glykogen, neutrale Mukopolysaccharide, Glykolipide, Basalmembranen, Pilzhyphen, Hyalin, Mastzellgranula (Heparin), Kolloid der Schilddrüse, Chitin, Cellulose, Keratin, Kollagenes Bindegewebe, retikulares Bindegewebe, Stärke, Plasmazellen (Immunglobuline), Paneth-Körnerzellen
Aber was habe ich nun gemacht?:Ich habe überlegt ob man denn auch mal eine andere Farbe als das typische magenta der PAS-Reaktion erhalten kann.
Und so habe ich ein wenig rumprobiert und habe eine "blaue PAS-Reaktion" durchgeführt.
Ich habe statt Parrosanilin einfach Thionin verwendet wodurch das Reaktionsprodukt blau wird.
Dadurch das es sich somit von der fuchsinschwefligen Säure unterscheidet habe ich es thioninschweflige Säure genannt und die Reaktion PAT-Reaktion (Perjodacid-Thionin-Reaction)
Die Färbevorschrift bleibt fast gleich ausser das ich anschließend die Kerne nicht blau durch Hämalaun färbe sondern rot durch Kernechtrot.
Herstellen von Kernechtrot:0.1g Kernechtrot in 100ml heisser 5%-iger Aluminiumsulfat-Lösung lösen
Nach dem erkalten filtrieren und 1 Tropfen Eisessig zusetzen
Hier nun ein kleiner Vergleich:
Diese Bilder zeigen das Duodenum einer Springmaus (Dipodidae)
Geschnitten habe ich unfixiert an einem Kryostaten (Gefrierschnitt) auf 4µm
Aufgezogen auf SuperfrostPlus Poly-Lysin-Objektträger
getrocknet bei 45°C
Nachfixierung mit 60% Aceton bei -20°C für 10min.
(Schlechte Schnittqualität durch zu altes Keramikmesser)
links PAS-Reaktion und rechts PAT-Reaktion

Die Bilder zeigen den Uterus eines Teichmolches (Lissotriton vulgaris)
Fixierung in Bouin
Geschnitten nach Paraffineinbettung (V-HartParaffin Typ5 von ThermoFisher) an meinem Microm HM355s Rotationsmikrotom mit einem Keramikmesser auf 0.9µm
Aufgezogen auf SuperfrostPlus Poly-Lysin-Objektträger
getrocknet bei 45°C
links PAS-Reaktion und rechts PAT-Reaktion
Ich bin gespannt was ihr davon haltet!
Mein Fazit ist das mit der PAT-Reaktion, durch den besseren Farbkontrast als bei der PAS-Reaktion, auch kleinste Mengen der nachzuweisenden Strukturen sichtbar gemacht werden können.
Am besten zu sehen an der Schleimauflagerung auf den Zilien beim Uterus des Teichmolches.
Ich hatte leider keine Zeit mehr Bilder zu machen, aber für einen ersten Eindruck ist das ausreichend denke ich.
Bei Gelegenheit folgen natürlich weitere Bilder.
Ich finde solche Farbexperimente lohnen sich hin und wieder
