Kombination aus AL Fluoreszenz und DIC bzw. Phasenkontrast

[anne]

Hallo Forum,

in meinem Vanox Prospekt wird von "multi-mode observation possible by mounting phase-contrast and DIC units to the reflected light fluorescence attachment"

Versteh ich das richtig, es soll DIC mit Fluoreszenz oder Phasenkontrast mit Fluoreszenz in Kombination anwendbar sein?
Wenn ja, gibt es hierzu eine Anwendung und evtl. sogar Beispielbilder?

Ein spezielles Objektiv welches für die Fluoreszenz ist und einen Phasenring hat, hätte ich sogar.

lg
anne

[JB]

Hallo Anne,

Gemeint ist weniger die gleichzeitige Beobachtung (ist aber auch moeglich, wenn die Fluoreszenz ausreichend hell ist), sondern die konsekutive Beobachtung, also Objekt im Phasenkontrast finden (verhindert das Ausbleichen), dann schnelles Umschalten auf Fluoreszenz.

Nacheinander gemachte Aufnahmen koennen dann nachtraeglich ueberblendet werden. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorophase.html

Bei Fluoreszenz und DIK sollte man aufpassen, dass kein UV verwendet wird, da dies die Pol-Filter schaedigt.

Beste Gruesse, Jon

[anne]

Hallo Jon,
es wird speziell im Zusammenhang mit einer starken Beleuchtung (200W) darauf hingewiesen und von "simultaneous observation" gesprochen.
Die DIC Prismen werden hier direkt im Fluoreszenz Kondensor eingebracht aber auch am Durchlicht Kondensor.
Der Tip mit dem UV Licht und den Prismen ist auf jeden Fall hilfreich um sich nicht die Prismen zu beschädigen.

lg
anne

[Rene]

Hi Jon,

Combining fluorescence and brightfield (or phasecontrast) is no problem, simply adjust lighting to such a low level that it is in balance with the fluorescence signal. A near UV filter cube for epifluorescence is ideal as it does not visibly change the spectrum of the transmitted (brightfield) lighting.

I used to make cryosections of tobacco leafs with DAPI (DNA stain), combined with DIC. It worked well on an Axiophot. However, on my Olympus IMT-2 it does not work due to fact that the polarizer blocks UV light. It is combined with the DIC prism and is in the lightpath of the excitation light. I'm not sure how it is arranged on a Vanox. But I'm sure you will find out quickly enough.

Good luck, René

[reblaus]

Hallo Anne -

Zeiss(W) hat schon vor ca. 50 Jahren einen speziellen Phasenkondensor geliefert, bei dem die Phasenblenden (1, 2 3)  im Kondensor aus Polfolie bestanden. Beleuchtet hat man durch einen drehbaren Polarisator, sodass man durch Verdrehen des Polarisators das Durchlicht durch den Ring variabel bis auf fast Null abschwächen konnte, um es an die vergleichsweise schwache Auflichtfluoreszenz anzupassen. Ist also gar nicht so neu.
Die Phasenringe im Objektiv stören eigentlich die Auflichtfluoreszenz kaum, man hat dafür ganz gewöhnliches Phasenobjektive, vorzugsweise Neofluare, genommen.

Viele Grüße

Rolf

[JB]

Combining fluorescence and brightfield (or phasecontrast) is no problem, simply adjust lighting to such a low level that it is in balance with the fluorescence signal. A near UV filter cube for epifluorescence is ideal as it does not visibly change the spectrum of the transmitted (brightfield) lighting.

Hi Rene,

You're right; that's possible when the fluorescence is quite bright, as with DAPI. When the fluorescence is dimmer, as it is the case with most immunodetections, and when UV is to be avoided, as with all living material, it's much easier to optimise fluorescence and phase contrast image separately and then do a digital composite.

Jon

[ortholux]

Liebe Anne,

einen ähnlichen Kondensor gab es auch von Leitz. Den 402aa. Dieser war identisch mit dem 402a, jedoch zusätzlich mit Filtern bestückt:
1: Ph I
2: Ph II, UV
3: Ph II, blau
4: Ph III, UV
5: Ph III, blau



Allerdings alles für die Durchlichtbeleuchtung anglegt.


Für AL-Fluoreszenz/Phaco gab es Phaco-Öl-Objektive bis runter zum 10er, um die Lichtausbeute mittels hoher Apertur möglichst groß zu halten.

Und für hohe Beleuchtungsstärken gab es Prismenpoalrisatoren, damit keine Folie verbrennt.
Links: Folie, rechts: Prisma und in der Mitte ein Schmankerl für sehr hohe Beleuchtungsstärken: ein Prisma mit seitlichem Austritt des außerodentlichen Strahls, damit dieser das Prisma nicht zusätzlich erwärmt.



Oder hier ein DIK-Kondensor mit Prisma:




Das alles schon in den späten 60er/frühen 70er Jahren zu haben.

Wofür? Dafür bin ich zu wenig Anwender. Aber ein Beispiel wurde ja schon genannt.

Viele Grüße
Wolfgang

[anne]

Hallo Rolf und Wolfgang,
vielen Dank für die ausführlichen Antworten.
Inzwischen habe ich gesehen, dass die vorhandenen DIC Prismen wohl auch speziel für den UV Bereich sind.
Das PH-Objektiv, ist wie Wolfgang schon sagt sehr hochaperturig, DPlan 40 UV PL 1,4 Öl.
Das Vanox ist ja nun aber auch schon ein recht gediegenes Gerät.
Können den die neuen Zeiss Mikroskope auch solche Kombinationen?
Oder ist das eher eine ältere Methode von der man inzwischen aufgrund neuer Technologien abgekommen ist?

Falls irgend jemand ein Bild hat oder findet von DIC kombiniert mit Fluoreszenz, wäre ich sehr neugierig darauf.

lg
anne

[ortholux]

Liebe Anne,

Holger hat hierüber einst berichtet.

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4451.0

Viele Grüße
Wolfgang

[anne]

Lieber Wolfgang,
super, genau so was wollte ich sehen.
Vielen Dank!

lg
anne

[Schrodt]

Hallo Anne,

zur weiteren Information noch einige Beispiele aus der Wild Leitz Broschüre " Fluoreszenzmikroskopie " von E. Becker (1989).
Vielleicht kannst du mit dem Vanox verschiedenes davon ausprobieren. Ich habe früher interessante Ergebnisse mit folgender
Gerätekombination erzielt: Mikroskop Leitz Orthoplan, Fluoreszenz-Auflichtilluminator PLOEMOPAK 2, Durchlicht Lampenhaus
100 Z mit Halogen-Glühlampe 12 V 100 W, Auflicht Lampenhaus 500 mit Xenon-Hochdrucklampe 150 W, Kombination der
Beleuchtungen mit Spiegelhaus 500 S.










Liebe Grüße
Jürgen aus Hemer

[anne]

Hallo lieber Jürgen,

vielen Dank für diesen Einblick, nun kann ich mir auch mehr darunter vorstellen, wofür diese Kombinationen sinnvoll sein könnten.

lg
anne

[TPL]

(...)Inzwischen habe ich gesehen, dass die vorhandenen DIC Prismen wohl auch speziel für den UV Bereich sind.
Das PH-Objektiv, ist wie Wolfgang schon sagt sehr hochaperturig, DPlan 40 UV PL 1,4 Öl.
Das Vanox ist ja nun aber auch schon ein recht gediegenes Gerät.
Können den die neuen Zeiss Mikroskope auch solche Kombinationen?
Oder ist das eher eine ältere Methode von der man inzwischen aufgrund neuer Technologien abgekommen ist?

Hallo Anne,

ich bin zwar überhaupt nicht "vom Fach" (das sind die Lebenswissenschaftler und Mediziner hier), aber ich habe ein Mikroskop, das ähnlich ausgerüstet ist: das Nikon Microphot FX. Auch dafür gab es eine Einrichtung für die Kombination aus Auflicht-Fluoreszenz und DIK, bzw. Phako und diese extrem hochaperturigen Objektive mit hoher Transmission im kurzwelligen Bereich bis ins UV (Fluor 40/1.4 Oil). Obwohl dieses Objektiv nicht besonders gut geebnet ist, lässt es sich mit dem im Fluorezenskondensor eingebauten DIK-Schieber zusammen verwenden. Andere Objektive haben außerdem noch einen Phasenring und ermöglichen damit einen Wechsel zwischen Phako und Fluoreszenz.

Holger hat in seinem von Wolfgang verlinkten Beitrag sehr schön gezeigt, wie sich Phasenkontrast und Fluoreszenz auch in einem Bild kombinieren lassen. Das finde ich zwar wirklich faszinierend, aber ob nun die Kombination der Methoden dem Ästhetischen dient, wage ich mal zu bestreiten (nicht gegen Holgers tolle Bilder). Ich glaube, es ist, wie Jon beschrieben hat, vor allem ein Werkzeug, das es erlaubt, ohne Objektiv oder sonst etwas ändern zu müssen, von einem Kontrastverfahren zum anderen zu wechseln (und dabei sowohl zu verhindern, das das Objektfeld ausbleicht, als auch, dass man es einfach nicht wiederfindet).

Viele Grüße
Thomas

[anne]

Hallo Thomas,

vielen Dank für Deine Erläuterungen!

Für mich ist es wohl in erster Linie eine Erweiterung der Spielwiese, die Anwendung als Kombination macht wohl nur, und wenn überhaupt, in der Histologie Sinn.

(und davon habe ich keinen blassen Schimmer...)

lg
anne

[reblaus]

Hallo Anne -

beim Tümpeln kann man damit Chloroplasten rot untermalen. Bringt zwar keine Zusatzinformation weil sie eh gefärbt sind, ist aber lustig.

Viele Grüße

Rolf