Wie färben ?

sirdul · Juni 06, 2009, 15:40:54 NACHMITTAGS

Hallo zusammen,

ich beschäftige mich zur Zeit mit dem Färben von botanischen Schnitten. Hierzu verwende ich Astrablau / Safranin bzw. Etzold´s Farbgemisch.
Die frischen, nicht fixierten Schnitte werden mit der Farblösung versehen, nach dem Färben mit Wasser 2 mal gewaschen und anschließend wird mit 100% Isopropanol differenziert. Einschluss in Malinol über eine Xylolstufe.
Bei der Differenzierung mit 100 % Isoproanol kann es nun zu unschönen Schrumpfungen kommen. Wenn ich nun über eine Alkoholreihe entwässere ( 30 %, 50%, 70 %, 80 %, 2 X 100 % ), wo schiebe ich den Färbevorgang ein ? Ist es notwendig, vor der Färbung mit Wasser den Alkohol zu entfernen ?
Gefühlsmäßig würde ich nach der Entwässerungsreihe mit Wasser 2 mal waschen, färben, mit 100 Isopropanol differenzieren, in Xylol waschen und in Malinol eindecken.
Liege ich da richtig ?

mfg

Ludger Benning

Ralf · Juni 06, 2009, 16:40:44 NACHMITTAGS

Zitat von: sirdul in Juni 06, 2009, 15:40:54 NACHMITTAGS
Gefühlsmäßig würde ich nach der Entwässerungsreihe mit Wasser 2 mal waschen, färben, mit 100 Isopropanol differenzieren, in Xylol waschen und in Malinol eindecken.

Hallo,

ich bin zwar kein Spezialist für die Färbung botanischer Schnitte, aber es erscheint mir unsinnig erst zu entwässern um dann 2 mal mit Wasser zu waschen.

Evtl kann man die Schrumpfungen vermeiden indem man mit 70% oder nur 50% Isoprop. differenziert. Meine Flechtenschnitte verbiegen sich auch, wenn ich direkt in 100 % Isoprop. entwässere, daher fange ich mit 50 % Isoprop an. Ich nehme Euparal zum Eindecken, das ist anerkanntermaßen sehr unproblematisch. Z. B. kann dann das Arbeiten mit Xylol entfallen.

sirdul · Juni 06, 2009, 17:16:39 NACHMITTAGS

Hallo Ralf,

ja, das klingt unlogisch. Ich ging bei meiner Überlegung davon aus, dass das Material über die Alkokolreihe fixiert wird, und bei den Waschvorgang nur der Alkohol entfernt wird.
Den Tipp mit 50 % Isopropanol zu differenzieren werde ich bei der Astrablau / Safranin Färbung versuchen. Laut Mikrofibel muss bei der Etzold-Färbung mit 100 % Isopropanol differenziert werden. Euparal kannte ich vorher nicht und ich besitze nun 250 ml Malinol, das wird für viele Schnitte reichen.

Und irgendwie mag ich den Geruch von Xylol. Es erinnert mich an meine Kindheit.

mfg

Ludger Benning

Rolf-Dieter Müller · Juni 07, 2009, 18:07:18 NACHMITTAGS

Hallo Herr Benning,

die ersten zu beachtenden Hinweise haben Sie ja schon von Ralf Wagner enthalten.

Ich möchte sie noch mit ein paar Anmerkungen ergänzen.

1. Für Dauerpräparate sollten Sie in jedem Fall fixieren, z.B. in AFE (90 Teile 90% Ethanol - 5 Teile Formalin- 5 Teile Eisessig). So vermeiden Sie spätere Schrumpfungen im Einschlussmittel und das Präparat bleibt auch dauerhaft haltbar. Mit unfixiert eingeschlossenen Schnitten werden Sie nur begrenzt Freude haben.

2. Zweifachfärbung mit Astrablau/Safranin
2.1. Schnitte aus 70% Ethanol über 50%igem Ethanol und 30%igem Ethanol in Wasser.
2.2 Wasser 2x wechseln
2.3 Für 3 Minuten in Astrablaulösung färben.
2.4 In Wasser auswaschen.
2.5 Überfärbung für 5 Minuten in Safraninlösung.
2.6 Überschüssige Farbe in Wasser auswaschen, 2x wechslen.
2.7 Schnitte in 70% Ethanol differenzieren (kein Isopropylalkohol!) bis keine Farbwolken mehr abgehen und der ursprüngliche Blauton bei unverholzten Zellgewebe wieder zu sehen ist (Lupenkontrolle!).
2.8 Schnitte in 100% Isopropylalkohol. Isopropylalkohol nach 30 Sekunden und nach 2 Minuten wechseln, letzte Stufe ca. 5 Minuten.
2.9 Xylol und dann Einschluss in Malinol.

3. Etzold's Farbgemisch
Hier gibt es zwischenzeitlich drei Varianten, die z.T. unterschiedlich zu handhaben sind. Um Ihnen zu helfen, müssten Sie die in Ihrem Gemisch enthaltenen Farbstoffe angeben.

Aber probieren Sie erst einmal die o.g. Zweifachfärbung und berichten über den Fortschritt.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller

sirdul · Juni 07, 2009, 19:07:03 NACHMITTAGS

Hallo Herr Müller,

besten Dank für Ihre Anleitung hinsichtlich der Zweifachfärbung mit Astrablau / Safranin und der Mitteilung, dass für Dauerpräparate fixiert werden muss. Ein Problem stellt die AFE Lösung da, es ist mir nicht gelungen Fomalin zu beziehen. Für die ersten Versuche jedoch war Herr Dr.Kramer hilfsbereit und stellte mir AFE zur Verfügung. Liegen Ihrerseits Erfahrungen mit alternativen Fixiermittel, z.B. von der Firma Chemlab2007, vor ?
Eine Frage zu Punkt 2.1: kann hier auch Isopropanol verwendet werden ?
Zu Pkt. 3. Das Etzold´s Farbgemisch habe ich als Fertiglösung von der Firma Chroma bezogen. Ich werde nachfragen, welche drei Farbstoffe verwendet wurden.

mfg

Ludger Benning

Rolf-Dieter Müller · Juni 07, 2009, 20:27:13 NACHMITTAGS

Zitat von: sirdul in Juni 07, 2009, 19:07:03 NACHMITTAGS
...
Ein Problem stellt die AFE Lösung da, es ist mir nicht gelungen Fomalin zu beziehen. Für die ersten Versuche jedoch war Herr Dr.Kramer hilfsbereit und stellte mir AFE zur Verfügung. Liegen Ihrerseits Erfahrungen mit alternativen Fixiermittel, z.B. von der Firma Chemlab2007, vor ?
Eine Frage zu Punkt 2.1: kann hier auch Isopropanol verwendet werden ?
Zu Pkt. 3. Das Etzold´s Farbgemisch habe ich als Fertiglösung von der Firma Chroma bezogen. Ich werde nachfragen, welche drei Farbstoffe verwendet wurden.
mfg
Ludger Benning

Hallo Herr Benning,

verwenden Sie für absteigende Alkoholreihen und zum Differenzieren Ethanol. Hilfsweise können Sie bei der beschriebenen Färbung auch Brennspiritus nehmen.

Erfahrungen mit alternativen Fixiermitteln habe ich nicht. Sie können aber statt AFE auch ein Gemisch von Alkohol - Eisessig verwenden. Ich meine hierfür die Rezeptur im Kremer gesehen zu haben (Kapitel Fixiergemische).

Wenn Sie Etzold von Chroma bezogen haben, ist es mit hoher Wahrscheinlichkeit Etzold FCA (in jedem Fall aber nachfragen). Dann gehen Sie wie bei der o.g. Zweifachfärbung vor, lassen aber unbedingt den Schritt 2.7 aus. D.h. die gefärbten Schnitte aus Wasser direkt in 100% Isopropylalkohol und das schnell wechseln.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller

Günter · Juni 07, 2009, 21:54:35 NACHMITTAGS

Hallo,

für den Ersatz von AFE gab es im Forum eine Rezeptur von Nicolas Liem / Detlef Kramer: Essigessenz und Spiritus (besser vergällter Ethanol) 1 : 1 womit man eine Mischung von 50 % Ethanol und ca. 12 % Eisessig erhält. (siehe http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=1337.0 ).
Und das mit haushaltsüblichen Mittelchen.

viele Grüße
Günter

Peter V. · Juni 07, 2009, 22:02:58 NACHMITTAGS

Hallo!

Wenn größeres Interesse bestünde, wäre ich ggf. bereit, das AFE-Gemisch herzustellen und Interessierten gegen einen kosteneckenden Obolus zuzusenden. Allerdings nicht sofort, ich bin ( noch lange ) nicht im Ruhestand und könnte das gelegentlich nur einmal machen, um die ärgste Not zu lindern. ( ich bin selbst froh, daß ich gerade etwas "schnorren" konnte

). Und es müßten sich dann schon ein paar Abnehmer finden, denn ich würde dann einmalig einen Ansatz machen. Vielleicht melden sich mal Mikroskopiker mit AFE-Bedarf und benötigter Menge, damit ich abschätzen kann, ob sich das lohnt.

Herzliche Grüße
Peter

PS: Eine Frage an unsere Chemiker: Mein AFE riecht angenehm fruchtig..... evtl. Essigsäureethylester? ( Bildet der sich spontan ohne Katalysator in diesem Gemisch? )

Detlef Kramer · Juni 07, 2009, 22:27:30 NACHMITTAGS

Hallo,

nur ein Zwischenwurf, denn ich bin etwas müde nach unserem Treffen in DA.

Für die Pflanzenanatomie braucht man wirklich kein Formaldehyd, so lange es nicht auf intrazelluläre Strukturen ankommt. Die Mischung aus Ethanol und Essig genügt völlig.

Fuchsinüberfärbung kann man nur mit Ethanol abschwächen (differenzieren).

Sowohl für Malinol, als auch Euparal (auch das neue Includal CB) genügt ein kurzes Zwischenbad in Isopropanol; Xylol ist entbehrlich.

Zu den alternativen Fixiergemischen von Chemlab werde ich noch Erfahrungsberichte nachliefern.

Herzliche Grüße und Gute Nacht,

Detlef Kramer

sirdul · Juni 09, 2009, 18:42:14 NACHMITTAGS

Hallo Herr Müller,

heute kam die Antwort von der Firma Waldeck, Abt.Chroma. Folgende Komponenten sind in der Mischung enthalten:
Fuchsin basisch
Chrysoidin
Astrablau fm
, als FCA. Das Kürzel fm hinter Astrablau kann ich nicht deuten.
Eine Bitte, hätten Sie ein Bild von dieser Farbmischung, die eine gelungene Färbung zeigt ?

mfg

Ludger Benning

Rolf-Dieter Müller · Juni 09, 2009, 19:22:52 NACHMITTAGS

Zitat von: sirdul in Juni 09, 2009, 18:42:14 NACHMITTAGS
Hallo Herr Müller,

...
Eine Bitte, hätten Sie ein Bild von dieser Farbmischung, die eine gelungene Färbung zeigt ?
mfg
Ludger Benning

Hallo Benning,

ich verweise einmal auf ältere Beiträge von mir:

http://www.mikroskopie.de/mikforum/read.php?2,44682,44682#msg-44682
oder
http://www.mikroskopie.de/mikforum/read.php?2,47622,47622#msg-47622

Sollten Sie hierzu oder zu ihren eigenen Färbungen Fragen haben, sprechen Sie mich ruhig noch einmal an.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller

sirdul · Juni 27, 2009, 19:26:07 NACHMITTAGS

Hallo zusammen,

es hat zwar etwas gedauert, aber ich möchte nun zwei Schnitte eines Fliederstengel zur Diskussion stellen.
Der Stengel wurde in AFE fixiert. Mit Hilfe eines Handmikrotoms wurden Schnitte erstellt. Anschließend erfolgte die Färbung mit Astrablau / Safranin bzw. FCA- Etzold nach
der Färbevorschrift von Herrn Müller. Anstelle von Ethanol wurde Brennspiritus verwendet. Bei der Etzold-Färbung wurden zwei Isopropanolstufen von je 30 Sekunden Dauer nach dem
Färbebad verwendet.
Mikroskop Standard 18, Objektiv Neofluar 6,3, Okular KPL 10, Beleuchtung LED nach Hiller. Kamera Canon PS A 520.
Die Bilder wurden leicht aufgehellt und geschärft. Kein Stacking von mehren Fotos.

Bild 1: Astrablau / Safranin

Bild 2: FCA-Färbung nach Etzold

Ich freue mich Kritik !

Ludger Benning

Klaus Herrmann · Juni 28, 2009, 11:09:33 VORMITTAG

Hallo Ludger,

sieht doch ganz gut aus:

Bitte um Verzeihung, dass ich etwas drin rum gepfuscht habe.

Aber es war nicht ganz klar, ob es an der Aufnahme liegt. Vielleicht etwas überbelichtet? Oder ob die Färbung wirklich so blass rauskommt.
Im letzten Fall hättest Du vielleicht etwas viel differenziert. Da hilft vor dem Eindecken nochmals Nachfärben und die Prozedur neu zu beginnen. Lohnt sich, wenn der Schnitt an sich gelungen ist. Was hier ja zutrifft!

Eigentlich würde ich da noch was Verholztes (Zweig!) erwarten - somit sollte noch ordentlich rot erscheinen. Das würde dann schon auf zu viel Differenzierung hindeuten!

Bei der A 520 gibt es auch eine Einstellung "Kräftig". Mit der werden die Kontraste angehoben. Könntest Du mal versuchen. Was ich gemacht habe steht Dir mit der Zoom Browser Ex- Software von Canon auch zur Verfügung

sirdul · Juni 28, 2009, 17:50:37 NACHMITTAGS

Hallo Klaus,

die Färbung ist so blass und ich stimme Dir zu, dass der Schnitt zu stark differenziert wurde. Eine Stufe Iso hätte wohl genügt.
Das der Schnitt so wenig rot zeigt, liegt meiner Meinung nach daran, dass es ein junger Zweig war. Es handelt sich bei dem Strauch um einen Schmetterlingsflieder, Buddleja davidii, der nichts mit dem Flieder Syringa vulgaris zu tun hat. Dies ist im meinem unteren Beitrag leider irreführend. Dafür nun ein Schnitt durch ein Ästchen eines "echten" Flieders:

Hierbei wurde nicht fixiert, sondern frisch geschnitten und gefärbt. Anschließend kurz differenziert in Iso und in Wasser mikroskopiert. Der Zellinhalt ist noch erhalten.
Ich bin erstaunt, welche Farbenvielfalt und Leuchtkraft diese Färbung besitzt. Leider kommt dies auf der Fotografie nicht so gut zur Geltung.
Eine Frage an die Botaniker: um welche Art von Zellen handelt es sich bei der zweiten Schicht von außen ? Ist sie für das Dickenwachstum zuständig ? Sie nimmt keine Farbe an. Anbei eine Vergrößerung des Bereiches.

Objektiv: Neofluar 40, Okular KPL 10, Kamera Canon PS A 520.

Mit freundlichem Gruß

Ludger Benning

Klaus Herrmann · Juni 28, 2009, 17:57:23 NACHMITTAGS

Hallo,
nun wollte ich doch mal sehen, wie Flieder aus unserem Garten rauskommt. Hier 2 Bilder von Schnitten die ich mal auf die Schnelle gemacht habe. Handschnitt mit Etzold und Etzold grün gefärbt. Kurz mit 70% Ethanol differenziert und dann aus Isapropanol in Eupral eingedeckt. Der Weißabgleich stimmt jetzt, morgen gibts mehr Bilder und zusätzliche Info.

Nach dem Schnitt habe ich ca 1h in AFE fixiert.

Die Eindeckung ist noch ganz frisch, morgen sollten die Farben noch etwas intensiver werden.