Paraffinschnitte erste Gehversuche

Gernot Armbruster · Oktober 16, 2018, 10:59:57 VORMITTAG

Lieber Jürgen,

danke für Deine Tipps. Ja, die Paraffinblöcke sind auf Holzklötzchen aufgeschmolzen. Über das Kühlen habe ich auch schon gelesen. aber wenn ich die Klötze aus dem Kühlschrank nehme und auf dem Mikrotom wieder einrichten muss sid sie zum Schneiden wieder warm. Da werde ich mir etwas einfallen lassen. Eventuell den Block am Mikrotom mit einem Eiswürfel kühlen?

Die letzten Bilder stellen die Schnitte unmittelbar nach dem Auffischen dar.

Beim Trocknen mit 50,5°C werden die Schnitte maximal glasig.

Bei meiner Beschreibung der Prozessschritte habe ich noch vergessen zu sagen, dass ich nach Aufbringen von 2-Propanol den Schnitt mit einem kleinen Hütchen abdecke, weil sonst das 2-Propanol zu schnell verdunsten würde. ( Kunststoffdöschen von der Hotelmarmrlade).

Schöne Grüße

Gernot

Jürgen H. · Oktober 16, 2018, 13:00:31 NACHMITTAGS

LieberGernot

als ich noch mit Holzklötzchen geschnitten habe, habe ich diese Klötzchen zweistufig zugeschnitten. Der schmalere Teil verschwand in der Klammer des Mikrotoms, der breitere Teil lag auf der Klammer auf. Damit ließe sich die Position des Klötzchens gut reproduzieren, na sagen wir mal einigermaßen. Das Kassetensystem war dann schon eine große Verbesserung.Vielleicht gehst Du zum Schneiden mal einfach in den kühlen Keller?

Eine Kühlung mit Eis führt natürlich dazu, dass das Holz nass wird und quillt. Solange sich der Paraffinblock dabei nicht löst, ist das bei Deiner Schnittstärke aber wohl gleichgültig.

Ich weißnicht wie schnell zu schneidest. Aaber Dein Problem könnte auch damit zusammenhängen, dass die Schnittgeschwindigkeit zu schnell ist.

Mit der Tropfmethode handelst Du Dir anscheinend Deinen Schmutz ein, der um Dein Objekt liegt.Vielleicht solltest Du doch überlegen, einen Kleber zum Kleben Deiner Schnitte zu verwenden.

Schöne Grüße

Jürgen

Gernot Armbruster · Oktober 17, 2018, 14:59:41 NACHMITTAGS

Lieber Jörg,

um eine Reproduktion und Kühlung zu ermöglichen habe ich mir ein Spezialklötzchen (Klotz) aus Aluminium gebastelt. Wegen der großen Masse hält es lange kühl, wenn es aus dem Kühlschrank kommt. Und es steht fest am Boden der Eispannvorrichtung des Mikrotoms.

Ich habe also mit 20Mü geschnitten, gekühlt geschnitten, alle möglichen Schnittgeschwindigkeiten probiert, verschiedene Schittwinkel probiert, Mit 47°C -Bad gestreckt, aber die Risse treten noch immer auf. Liegt es vielleicht am Messer? Sind Einmalklingen mit Klingenhalter besser geeignet? In der professionellen Mikroskopie sieht man nur solche, oder hat das andere Gründe? ich habe auch die Schnittfläche des Klötzchens im Auflichtmikroskop betrachtet. Da gibt es noch keine Risse. Diese entstehen also eindeutig beim Schneiden.

Schöne Grüße

Gernot

Jürgen H. · Oktober 18, 2018, 10:16:21 VORMITTAG

Lieber Gernot,

ZitatLiegt es vielleicht am Messer

Ich denke eher nicht. Ein wenig verwundert bin ich, dass Du für 20 mü ein B Messer benutzt. Aber wenn das nicht flattert, was Du an feinen Querrillen über der Blockoberfläche sehen würdest und es scharf ist,wird das Messer nicht die Ursache sein.

ZitatSind Einmalklingen mit Klingenhalter besser geeignet? In der professionellen Mikroskopie sieht man nur solche, oder hat das andere Gründe?

Die Stahlmesser muss man pflegen, abziehen und regelmäßig schleifen. Die Einmalmesser werden weggeschmissen, wenn sie nicht mehr benutzbar sind. Stahlmesser sind fantastisch, wenn man das Abziehen versteht.

Wenn ich Dein letztes Bild betrachte, habe ich etwas Zweifel daran, dass der Block in Ordnung ist. Die Stelle, an der das Objekt eingebettet ist, sieht völlig anders aus, als die Umgebung. Natürlich erkennst Du das Objekt im Block auch bei korrekter Einbettung. Aber bei korrekter Infiltration muss alles gleichmäßig! im Wachs liegen. Da dürfen keine milchig hellen oder leicht bröselig erscheinenden Stellen sein.

Kannst Du mal eine gute Auflichtaufnahme vom Block machen? Hast Du einen anderen Block für einen weiteren Versuch? Eventuell hilft, den Block mit dem Gesicht ein paar Minuten auf eine feuchte! Eisfläche zu legen oder ihn in ein Gefäß mit Eiswasser zu stellen. Wenn das Xylemgewebe überprozessiert ist, kannst Du Dir eventuell so helfen.

Jürgen

Ronald Schulte · Oktober 18, 2018, 10:58:41 VORMITTAG

Gernot,

Leica hat auch ein Dokument erstellt, in dem die meisten Paraffinprobleme nicht nur beschrieben, sondern auch mit vielen Bildern erklärt werden". Es werden verschiedene Lösungen angeboten. Kann als pdf kostenlos heruntergeladen werden.

Link zu diesen Artikel ist: https://www.leicabiosystems.com/fileadmin/academy/2011/95.9890_Rev_A_Difficult_Blocks.pdf

Und denke daran das es viel Übung kostet um gute schnitte herzustellen und nur von viele Fehler kann man lernen.

Grüße Ronald

Rawfoto · Oktober 18, 2018, 22:27:19 NACHMITTAGS

Hallo Gernot

Ich schneide Blöckchen auch mit dem B- Messer, diese müssen mit den passenden Abziehülsen so alle 30 bis Max 50 Schnitte neu abgezogen werden ...

Wenn Du das nicht machst bekommst Du schnell Probleme ...

Auch bei den Einmalklingenhalter gibt es viele unterschiedliche Typen, Feather und Leitz Microsystems sind die verbreitetsten. Alle Einmalklingenhalter sind nicht so scharf wie ein Ideal aufbereitetes B-Messer ...

Liebe Grüße

Gerhard

Gernot Armbruster · Oktober 19, 2018, 22:41:25 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen,
hier ein Auflichtfoto vom Klötzchen. Ein anderer Block ist bereits in Bearbeitung. Ich habe jetzt auch den Anstellwinkel des Messers genau vermessen und kann dadurch den Freiwinkwl auf genau 3° einstellen. Und welch Überraschung, es kommen lauter gleichmäßige unaufgerollte oder gestauchte Schnitte daher.

Hallo Ronald,
danke für den super Link.

Hallo Gerhard,
viele Tips für die Mikrofotografie habe ich mir aus einem Buch von einem gewissen G. Zimmert geholt. Kennst Du den vielleicht?

Jürgen H. · Oktober 20, 2018, 08:24:00 VORMITTAG

Lieber Gernot,

ich denke, dass damit die Hauptursache klar ist Der Block ist nicht gut infiltriert. Im Übrigen vibriert Dein Messer ganz fein. Das kann am zu steilen Freiwinkel liegen. Wenn das Photo aber nach einem Schnitt mit 3 Grad gemacht ist, scheidet der Winkel als Ursache aus. Sind Messer und Messerhalter wirklich festgeschraubt? Ist das Messer an einem Punkt oder an zwei Punkten befestigt? Was für ein Schlittenmikrotom hast Du? B Messer sind natürlich instabiler als C Messer und neigen daher zu Vibrationen, insbesondere, wenn Hartes dick geschnitten wird. B ist ein vorzügliches Messer, um Planzen frisch ziehend zu schneiden.

Kennst Du das hier?

http://www.klaus-henkel.de/cut-mikrotom.html

Schöne Grüße und viel Erfolg, ich bin gespannt auf den nächsten Block!

Jürgen

Bob · Oktober 20, 2018, 08:39:00 VORMITTAG

Guten Morgen zusammen,
ich habe mal ein grundsätzliche Frage: Bietet ein Schnitt aus Paraffineinbettung heraus bei diesem Objekt einen Vorteil gegenüber einem Schnitt frisch, z.B. einfach mit Handmikrotom und Klingenhalter? Es ist vermutlich eine geringere Schnittdicke möglich, aber stellt die einen Vorteil fürs Präparat dar? In Paraffin einbebettet könnte ich z.B. eine Blüte quer schneiden und hätte die Blütenblätter alle mit in Position im Präparat, was ohne Einbettung nicht gelingen würde. Aber bei so einem Stiel ist der Unterschied doch vermutlich gering?

Viele Grüße,

Bob

Dr. Jekyll · Oktober 20, 2018, 08:57:32 VORMITTAG

Hallo Bob,

Dass siehst Du richtig. Die Paraffineinbettung ist in der Botanik hauptsächlich dann notwendig, wenn Objekte beim Schneiden zerfallen und nicht an ihrer Position bleiben. Bei einem Pflanzenstengel ist der Aufwand viel zu groß und überflüssig. Man kann die Stängel auch so hinlänglich dünn schneiden. Zu dünne Pflanzenschnitte sind ohnehin meist nicht in der Lage beim Färben genügend Farbstoff anzulagern, um schöne Ergebnisse zu liefern. Aber das ist Geschmacksache🙂🔬

Bob · Oktober 20, 2018, 09:10:34 VORMITTAG

Ich wollte das Vorgehen auch nicht in Frage stellen, irgendein Objekt muss man ja nehmen, um das Verfahren zu erproben. Das Paraffineinbetten möchte ich auch irgendwann mal ausprobieren.

Florian D. · Oktober 20, 2018, 09:52:47 VORMITTAG

Zitat von: Gernot Armbruster in Oktober 17, 2018, 14:59:41 NACHMITTAGS
Sind Einmalklingen mit Klingenhalter besser geeignet? In der professionellen Mikroskopie sieht man nur solche, oder hat das andere Gründe?

Hallo Gernot,

ein Grund für die Verwendung von Einmalklingen ist, dass es mit festen Klingen zur Verschleppung von Material von einem Schnitt auf den Anderen kommt. Z. b. der Analyse von Tumorgewebe wird aus den Schnitten DNA isoliert um den Tumor molekulargenetisch zu charakterisieren. Die Methode (Next Generation Sequencing, PCR) ist so empfindlich, dass DNA aus vorangegangenen Schnitten das Ergebnis verfälscht.

Viele Grüsse,
Florian

Dr. Jekyll · Oktober 20, 2018, 11:00:05 VORMITTAG

Hallo Bob,

Einen Vorteil hat das Einbetten in Paraffin doch noch, auch für Stengel. Die Proben sind Jahrzehnte lagerfähig. Ich habe Paraffinblöcke die 30Jahre alt sind und immernoch brauchbar sind.

Bob · Oktober 20, 2018, 11:22:23 VORMITTAG

Hallo Harald,
das ist natürlich ein deutlicher Vorteil. Ich stelle für mich fest, dass ich mich den selben Objekten gerne wieder mit neuen Methoden zuwende.

Viele Grüße,

Bob

JoachimHLD · Oktober 20, 2018, 13:03:28 NACHMITTAGS

Hallo Bob,
hier ein sicherlich nicht perfekter Vergleich eines Paraffin-Schnittes mit einem in Möhre-eingebettet Schnittes.
Das Markparenchym des Triebes der Süßkartoffel Ipomoea batata läßt sich nur im Paraffin-Schnitt erhalten. (Bilder sind außer Stitch unbearbeitet)
ohne Paraffin:

Mit Paraffin:

Viele Grüße
Joachim