Paraffinschnitte erste Gehversuche

Gernot Armbruster · Oktober 12, 2018, 20:44:42 NACHMITTAGS

Hallo Forum,

ich versuche gerade Paraffinschnitte zu verarbeiten. habe eine größere Anzahl von Paraffinblöcken mit Zoo-und botanischen Präparaten zur Verfügung, die ich vor Jahren von einer Schule für Medizinpersonal geschenkt bekam. Abgebildet ist ein erster Versuch eines mir unbekannten botanischen Präparates, geschnitten mit einem Schlittenmikrotom, eingestellt auf 15My. Den Schnitt habe ich in ein Streckbad mit 50°C verbracht und mit einem OT herausgefischt. Die weitere Verarbeitung geschah mit der Auftropfmethode, Entparaffinierung mit Rotihistol. Absteigende Alkoholreihe nach Vorschlag der Fa Roth, Färbung Mit meinem Spezialgemisch(siehe unten) und Aufsteigende Alkoholreihe (Isopropanol-Rotihistol) wieder nach Roth. Eindeckung mit Entellan.

Mir geht es dabei erst einmal um das Schneiden und das Handling der Verarbeitung zu üben. Um überhaupt eine Farbe einzubringen habe ich aus Fuchsin-Pulver und Mettylenblau flüssig ein Gemisch gebraut und auf gut Glück 5 Min. einwirken lassen. Obwohl sich im Laufe der Jahre ein beachtliches Arsenal an Farben bei mir angesammelt hat, bin ich noch ziemlich ratlos, wie ich diese am besten anwenden könnte. Für Ratschläge wäre ich sehr dankbar.

Das Bild zeigt nun so einen ersten Versuchsschnitt noch nicht mit Photoshop geputzt, um eine konstruktive Kritik zu ermöglichen, um die ich hier die Experten des Forums ersuche.

Schöne Grüße

Gernot

Klaus Herrmann · Oktober 13, 2018, 00:13:34 VORMITTAG

Hallo Gernot,

sieht doch gelungen aus. Vielleicht etwas zu dünn für den Anfang, bei 20µ würde er vielleicht weniger einreißen.. Wenn du so eine große Farbsammlung hast dann könntest du vielleicht Etzold blau mixen, das wäre sinnvoll und attraktiv und einfach anzuwenden. Ist sicher ein Lippenblütler Taubnessel, Lavendel und ....

Herstellungsvorschrift im Kremer Kosmos Großes Buch der Mikroskopie Im Zweifel bei mir fertig gemixt.

Rawfoto · Oktober 13, 2018, 07:35:04 VORMITTAG

Guten Morgen Gernot

Mit welchem Mikrotom(Typ) und welchem Messer(Typ) hast Du denn geschnitten? Da Du Ausrisse hast sind das wichtige Eckpunkte ...

Liebe Grüße

Gerhard

Klaus Herrmann · Oktober 13, 2018, 10:15:24 VORMITTAG

Hallo Gernot,

nach einer Nacht schlafen fällt mir ein: eigentlich müsste das Xylem rot sein? Ist es wahrscheinlich auch, aber bei der niedrigen Kondensorapertur säuft die Farbe ab. Zeig mal bitte einen Eckenausschnitt mit dem 10er Objektiv

MikroMicha · Oktober 13, 2018, 13:29:22 NACHMITTAGS

Hallo Gernot,

ich bin zwar absolut kein Spezialist auf diesem Gebiet, da ich eher aus der Tümpler-Ecke komme, aber aus meiner Zeit als Schüler und als damaliger Besitzer eines "Kosmos-Mikroskopiekastens" kann ich mich noch an die Astrablau-Safraninfärbung erinnern, die ich auch damals mit Erfolg angewandt habe. Bei meinen Recherchen bin ich dann noch auf folgenden Link gestossen: http://www.aeisner.de/methoden/farb1.html. Vielleicht hilft Dir das ja ein wenig. Deine "Schnitterstversuche" finde ich für den Anfang schon gut gelungen.

Gernot Armbruster · Oktober 13, 2018, 22:43:14 NACHMITTAGS

Hallo,

Danke für die Antworten.

@Klaus: Danke für die Tipps. Nach welchem Rezept bekommt man Etzold Blau? Ich habe zwar 24 verschiedene Färbemittel, die meisten in flüssiger Form, einige in Pulverform. Aber wenn ich ein bestimmtes Rezept verwirklichen will fehlt doch immer wieder das eine oder andere (aktuell zB. Crysoidin). Außerdem sind alle schon ziemlich betagt. Wie lange halten diese Reagenzien eigentlich?

Hier ein Bild eines Eckausschnittes aufgenommen mit dem Apochromat 12,5x0,35 oo/0,17-A Tubuslinse 0,8x geblitzt.

@Gerhard: Das Mikrotom ist ein Schlittenmikrotom Jung Heidelberg mit einem c-Messer.

@Michael: Danke für den Link, werde ich bei nächster Gelegenheit probieren.

Ich habe den Verdacht, dass die Risse davon kommen, weil ich die größten Probleme beim Auflegen des Deckglases habe. Immer wieder verrutscht es, wenn ich z.B. die empfohlene M8-Mutter drauflege. Beim nächsten Durchgang mache ich eine mikroskopische Zwischwnkontrolle, gleich wenn sich das Paraffin verzogen hat.

Liebe Grüße

Gernot

Klaus Herrmann · Oktober 13, 2018, 23:35:16 NACHMITTAGS

Hallo Gernot, na sage ich doch die Färbung ist gut gelungen, es lag nur am Foto.
Ich verwende einen speziellen Kondensor für große Gesichtsfelder, damit leuchtet man gut aus und hat trotzdem genügend Licht, dass die Farben nicht ins graue abdriften.

Zu den Farbrezepturen bzw Reagenzien schreibst du mir am Besten eine Mail.

Feststoffe halten sich oft sehr lange, Lösungen kann man nach längerer Zeit (einige Monate) durch filtrieren oft wieder gebrauchstüchtig machen.

Jürgen H. · Oktober 14, 2018, 08:14:18 VORMITTAG

Hallo Gernot,

die Risse treten vor allem an den äußeren Rändern des Xylems auf. Ich tippe daher auf eine unterschiedliche Ausdehnung der unterschiedlichen Strukturen bei einem der Prozessschritte. Die Paraffinsorte kennen wir leider nicht? Möglicherweise wird der Schnitt im Wasserbad zu sehr gestreckt, schwimmt ein wenig zu viel auseinander. Ich würde daher versuchen, die Temperatur des Wasserbades ein wenig herunter zu setzen, z.B. auf 47 Grad. Auch die ,,Auftropfmethode" kommt als Ursache in Betracht. Kannst Du den OT nicht kommplett in ein kleines Gläschen stellen? Die Risse könnten natürlich auch an der Einbettung liegen die wir ebenfalls nicht kennen.

Viel Erfolg

Jürgen

Gernot Armbruster · Oktober 15, 2018, 00:00:01 VORMITTAG

Hallo Jürgen,

Das Parrafin kenne ich leider nicht. Aber die Blöcke stammen von einer Schule für medizinisches Personal. Ich gehe davon aus, dass die ein anständiges Material verwenden. Ich habe noch einige Schnitte gemacht und in 47° Wasser gestreckt, dann einen Teil auf einem kleinen Leitz Gefriermikrotom und den anderen Teil auf dem Schlittenmikrotom geschnitten. Beim Gefriermikrotom bewegt sich das Messer auf einer Kreisbahn. Alles mit 15My. Morgen schneide ich noch einmal mit 25My und morgen verarbeite ich sie auch weiter. Ich werde auch jeden Arbeitsschritt unter dem Mikroskop prüfen und fotografieren. Ich glaube, dass man schon jetzt einen unterschied zwischen den Mikrotomen erkennen kann (siehe Fotos der rohen Schnitte Bild 1 Gefriermikrotom, Bild2 Schlittenmikrotom).
Die Methode in kleinen Behältern habe ich schon versucht, da schwimmen mir aber zu viele Proben weg.
Eingebettet habe ich in Rotikitt und in Entellan.

Schöne Grüße

Gernot

unkenheini · Oktober 15, 2018, 06:43:29 VORMITTAG

Moin,
Ist 75Grad nicht zu hoch..?ich dachte immer im Streckbad darf das Paraffin nicht schmelzen,um die Schnitte dadurch nicht zuzerreißen?Sollte man nicht immer so um die 5-7 Grad unter der Schmelztemperatur bleiben?
Mit freundlichen Grüßen Jörg

Gernot Armbruster · Oktober 15, 2018, 09:37:04 VORMITTAG

Hallo Jörg,

Danke für den Hinweis, ich hab mich verschrieben es sind 47°C. Hab es auch schon ausgebessert.

LG

Gernot

Jürgen H. · Oktober 15, 2018, 10:28:35 VORMITTAG

Lieber Gernot,

bitte beschreibe doch einmal Deine Prozessschritte etwas genauer. Bei welcher Temperatur schneidest Du mit welchem Messer, mit welchem Winkel? Klebst Du die Schnitte auf? Womit? Nur mit Wasser? Wie trocknest Du den Schnitt? benutzt Du eine Wärmeplatte?

Kennst Du das hier?

https://www.leicabiosystems.com/fileadmin/academy/2011/Microtomy_booklet_english_online.pdf

25 mü? Wozu dann Paraffin?

Schöne Grüße

Jürgen

Gernot Armbruster · Oktober 15, 2018, 20:50:20 NACHMITTAGS

Lieber Jürgen,

Zur Beschreibung der derzeit aktuellen Prozessschritte:

Schneiden auf dem Jung Schlittenmikrotom bei Zimmertemperatur von dzt. 20,7°C. Messer ist ein Jung b, obere Fläche leicht konkav, abgezogen auf Belgischem Broken und Biber-Lederstreichriemen. Den Freiwinkel habe ich durch Probieren ermittelt, (bis die Schnitte nicht mehr aufrollen). Die Schnitte werden mirt einem Pinsel Nr2 abgenommen und in das Streckbad mit 47°C überführt. Die gestreckten Schnitte fische ich mit einem gereinigten OT aus dem Bad und stelle sie schräg auf einer saugfähigen Unterlage mit dem Rücken an die Wand. Dann kommen die OT auf die Wärmeplatte mit kurzzeitig 50,5°C und bleiben dann bei 45,5°C über Nacht auf der Platte, abgedeckt mit einem Pappkarton. Die getrockneten OT weden dann in Transportbehältern bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt.

Die weitere Verarbeitung erfolgt nach Empfehlung der Fa. Carl Roth GmbH+Co.Kg:
Die Reagenzien werden mit Pipette aufgetropft und nach der Einwirkzeit durch Senkrechtstellen zum Ablaufen gebracht. Roth empfiehlt Ethanol, ich verwende aber 2-Propanol, weil ich da die ganze Reihe schon vorbereitet habe.
3x10 min Roti-Histol; 2x5 min 2-Propanol 99,5%; 2x5min 2-Propanol 95%; 2x5min 2-Propanol 80%; 2x5min 2-P 70%; 3x 5min Aqua dest.; 1x5min Etzold Färbegemisch; Spülen mit Aqua-dest.; 1x 5min 2-P 70%; 1x5min 2-P 80%; 1x5min 2-P 95%; 1x5min 2-P99,5%; 2x5min Roti-Histol; Grobe Reste von R-H werden vorsichtig abgetupft, ein kleiner Tropfen Eindeckmittel mit einem Glasstab aufgebracht und dann ein rundes Deckglas mit einer feine Pinzette laaangsam aufgelegt. als Eindeckmittel habe ich früher Roti-Histokitt genommen, das ist aber ziemlich dickflüssig und ich hatte damit Probleme mit Luftblasen. Jetzt nehme ich Entellan. Das ist dünnflüssiger und wird trotzdem schnell fest. Jetzt kommen die OT wieder auf die Wärmeplatte bei 45°C bis das Einschlussmittel fest ist.

Das ist also die ganze Prozedur im Detail.

25mü bzw. 20 mü möchte ich versuchen, weil mir das Klaus Herrmann vorgeschlagen hat. Paraffinschnitte mache ich deshalb, weil ich seit langem 30 Paraffinblöckchen und 3 Mikrotome besitze und ich endlich einmal dieses Handwerk erlernen möchte.

Danke für den super Link, den kannte ich noch nicht, Ist sicher eine interessante Sache für und von Profis, die man eben dann auf die bescheidenen Möglichkeiten eines Hobbymikroskopikers transformieren muß.

Liebe Grüße

Gernot

Bob · Oktober 15, 2018, 21:24:38 NACHMITTAGS

Hallo Gernot,
vielen Dank, dass Du uns an Deiner Entwicklung teilhaben lässt! Paraffinschnitt möchte ich irgendwann auch noch mal in Angriff nehmen, und so folge ich Deinem Fortschritt mit großem Interesse.

Viele Grüße,

Bob

Jürgen H. · Oktober 16, 2018, 08:24:48 VORMITTAG

Lieber Gernot,

ich vermute, Du hast den letzten Schnitt von links nach rechts geschnitten? Vielleicht versuchst Du einmal, Deinen Block ein wenig zu kühlen. Wahrscheinlich ist Dein Block auf eine Holzunterlage aufgeklebt? Dann würde ich ihn für einige Minuten in den Kühlschrank tun. Vermutlich ist es dann schwer, den Block wieder reproduzierbar in die Klammer des Mikrotoms einzuspannen. Falls Du ihn auf einer der Einbettkassetten hast, wäre es einfacher: Du könntest die Kassette in kaltes Wasser schmeißen. Der Winkel beim Schneiden wird sich vermutlich ändern. Die Schnittstärke wirst Du dann reduzieren müssen. Wenn die Ursache Deiner Risse unterschiedlich schneidbares Material ist (dichteres Xylem) könntest Du Dir so vielleicht helfen.

Betrachte einmal Deinen Schnitt unmittelbar nach dem Fischen aus dem Wasserbad. Sind die Abrisse am Xylem da auch schon vorhanden?

Beim Trocken stellst Du Deinen OT kurz bei 50,5 Grad auf die Wärmeplatte.Fängt da Dein Paraffin schon an zu fließen oder wird der Schnitt maximal glasig oder verändert sich Dein Paraffinschnitt nicht?

Schöne Grüße

Jürgen